応用生物実験の基本操作(Ver. 1.4)
− 安全に正しく実験を行うために −

Basic Procedures for Applied Biology Experiments (Ver. 1.3)

– For Carrying Out Experiments Safely and Properly

   
1.はじめに
1.1. 実験は危険を伴う
1.2. プロとしての自覚を持つ

2.安全に実験を行うために
2.1. 日常生活
2.2. ガラス器具の取扱い、洗浄
2.3. オートクレーブ
2.4. 遠心分離機
2.5. 恒温槽(インキュベーター)
2.6. 減圧操作
2.7. 紫外線ランプ
2.8. 試薬の取扱い
2.9. 液体ガス、ガスボンベの取扱い

3.正しく実験を行うために
3.1. 試薬、試料の保存
3.2. 天秤
3.3. メスピペット
3.4. ピペットマン
3.5. スターラー
3.6. ボルテックスミキサー
3.7. クリーンベンチ
3.8. pHメーター
3.9. 分光光度計
3.10. 電気泳動
1. Introduction
1.1 Experiments Are Essentially Dangerous
1.2 Being Professional

2. Carrying Out Safe Experiments
2.1 Daily Life
2.2 Handling and Cleaning of Glassware
2.3 Autoclave
2.4 Centrifuge
2.5 Thermostat Bath (Incubator)
2.6 Operation for Reducing Pressure
2.7 Ultraviolet Lamp
2.8 Handling of Reagent
2.9 Handling of Liquid Gas and Gas Cylinder

3. Carrying Out Proper Experiments
3.1 Storage of Reagent and Sample
3.2 Balance
3.3 Measuring Pipette
3.4 Pipetman
3.5 Stirrer
3.6 Vortex Mixer
3.7 Clean Bench
3.8 pH Meter
3.9 Spectrophotometer
3.10 Electrophoresis
   

1.はじめに

1. Introduction

1.1. 実験は危険を伴う

1.1 Experiments Are Essentially Dangerous

実験は、必要な注意を怠れば、人身事故、爆発火災事故につながります。特に以下のものを取扱う際には十分な予備知識と注意が必要です。  If you do not take sufficient precautions when carrying out experiments, accidents resulting in injury or fire and explosion may occur. In particular, when using the following, you must have sufficient background knowledge and should take sufficient precautions.
・危険な試薬、試料(引火性、爆発性、発ガン性、病原性・・・) • Dangerous reagents and samples (e.g., flammable, explosive, carcinogenic and pathogenic reagents)
・高温になる機器(電気機器は全て火災、火傷につながると考えよ) • Machines exposed to high temperature (consider that all electric apparatuses can cause fire or burn)
・高圧(陰圧)になる機器(オートクレーブ、エバポレーター・・・) • Machines exposed to high pressure (e.g., autoclave and evaporator)
・大きな運動エネルギーを持つ機器(遠心分離器、振とう培養機・・・) • Machines having high kinetic energy (e.g., centrifuge and shaking incubator)
・破損しやすい器具(ガラスなど) • Fragile items (e.g., glassware)
事故を起こせば、あなたは痛い目に合い、周囲の人にケガをさせることもあります。また、火災を起こせば、高価な研究機材だけでなく、金銭には代えることのできない貴重な試料やデータを失うことになります。 If you cause an accident, you may be injured and people around may also be injured. If you cause a fire accident, you may lose not only expensive research equipment but also very precious samples and data.
このような事態になれば、関係者に多大な迷惑をかけ、あなたは一生後悔することになります。また、操作を誤ったりメインテナンスを怠れば、高価な機器の寿命を縮めるだけでなく、実験が失敗したり、実験精度が大きく低下したりします。 If this situation occurs, you might cause much trouble to other persons that you might regret for the rest of your life. If you misuse or fail to maintain equipment, not only does the lifetime of expensive equipment shorten but also the experiment fails or the accuracy of equipment markedly decreases.
   

1.2. プロとしての自覚を持つ

1.2 Being professional

研究に使用する機器類はプロ用の機器です。家庭電化製品とは異なり、いい加減な使い方をしても事故が起こらないような配慮がなされていない機器も少なくありません。数年前に吹田キャンパス内でボヤがありましたが、その原因は学生が機械の操作に習熟していなかったためです。「知らなかったから」、「教えてもらっていないから」、「調べるのがめんどうだから」は言い訳になりません。「知っていたけど面倒だから」は言語道断です。 Apparatuses used for research are manufactured for professionals. Because many apparatuses are different from home electronic equipment, they are very dangerous when used carelessly. A few years ago, there was a small fire at the Suita campus, which was caused by a student who was not expert in machine operation. Excuses, such as “I did not know the right operational procedure,” “I have not learned how to use the equipment yet,” “it was too much bother to study the operational procedure preliminarily,” and “it was troublesome to follow the procedure even though I knew it” are never acceptable.
広辞苑によれば、「プロフェッショル:専門的、職業的」となっています。私達は研究を専門的、職業的に行うわけですから「プロ」なのです。どの世界に上記のような言い訳をするプロがいるでしょうか。どの世界に自分の使う道具に関する十分な知識を持たないプロがいるでしょうか。プロとしての自覚を持ち、実験を始める前に、あなた自身が、使用する実験機器や試薬の取扱いについて十分な下調べを行なわなくてはなりません(先輩や先生の使い方が正しいとは限りません)。実験機器を正しく使用し、実験の効率を上げ、精度に注意を払うことは研究者の基本的な義務の一つです。 In the dictionary (Kojien), “professional” means “technical, occupational.” You are a professional because you conduct a study technically and responsibly as a researcher. You must be a professional, and you must study the proper handling of the experiment and reagents to be used before starting the experiment to avoid oversight (seniors and instructors are not always right). It is one of the basic duties of a researcher to use an apparatus properly, improve the efficiency of the experiment and check the accuracy of the apparatus.
多くの失敗は「過失」であり、誰にでもあることですが、失敗を放置したり報告を怠るのは「故意」であり許されません。また、関係者に危害が及ぶのを知りながら危険な状態を放置することは犯罪行為であることも肝に銘じておかなければなりません。 Most accidents are a result of “human error,” which everybody commonly makes. However, leaving the scene of an accident unattended or neglecting to report an accident is not “human error.” It will not be tolerated. In addition, it is a criminal act to leave the scene of an accident unattended knowing that it may injure other people.
このテキストでは、生化学系実験における一般的な事項として、以下のことについてまとめてあります。このテキストに記載されていない特殊な機器類の使用にあたっては、各自が担当教員に十分な指導を受けた上、更に、自分自身で取扱い説明書を熟読して下さい。 In this text, the following summarizes the general procedures for biochemical experiments. When using special apparatuses, which are not mentioned in this text, receive sufficient instruction from the principal investigator or instructor, and carefully read the user instruction manual.
(1) 安全に作業を行うための注意事項 (1) Precautions for safe experimental operation
(2) 実験機器の寿命を縮めないために必要な注意事項 (2) Precautions for preventing shortening in lifetime of experimental apparatuses
(3) 実験を効率良く行い、精度を保つためのコツ (3) Procedures for carrying out experiments efficiently and maintaining good accuracy
   

2.安全な実験操作のために

2. Carrying Out Safe Experiments

2.1. 日常生活

2.1 Daily Life

2.1.1. 時間帯

2.1.1 Working time

指導教員がいる時間帯に実験するのが原則。指導教員が不在であれば、適切な指導を受けることができず、緊急時にも適切な対応ができない。また、教員のたった一言のアドバイスで失敗せずに済む(失敗をリカバーできる)場合も少なくない。以下の事故は何れも教員が不在の時に起こっている。 As a rule, carry out experiments with an instructor present. Without an instructor, you cannot get proper advice or properly respond to an emergency. There are many accidents that can be avoided (that can be recovered) with just one piece of advice from the instructor. The following accidents in Japanese Universities occurred when the instructor was absent.
・真空蒸着装置が爆発 院生2名が死亡 • Explosion of vacuum evaporation system resulting in the death of two graduate students
・ジーンパルサーで感電 院生が死亡 • Electric shock from the Gene Pulsar (electroporation machine) resulting in the death of one graduate student
・エーテル蒸留中に爆発 4年生が失明 • Explosion during ether distillation resulting in the blinding of one undergraduate student
・凍結乾燥用のバイアル瓶が爆発 院生が顔に裂傷を負う • Explosion of vial container for freeze-drying resulting in a face laceration in one graduate student
   

2.1.2. 異臭・異音に気づいたら

2.1.2 Abnormal odors or sounds

異臭・異音は事故の前兆である。異常反応、装置やケーブルの過熱、駆動部の摩滅、ガス漏れなど、放置すれば重大事故につながる可能性が高い。直ちに教員に報告し(例え夜中であっても)、指示を受けること。 Abnormal odors and sounds are warnings of an accident. If abnormal reaction, overheating of an apparatus or a cable, abrasion of a driving part and gas leakage are left untreated, there is a high risk of a serious accident. Immediately inform the instructor of the situation (even at midnight) and receive instruction on how to proceed.
   

2.1.3. 頭痛・体調不良

2.1.3 Headache or bad condition

実験中に頭痛がしたり、だるさなどの体調の不良を感じたら、実験を中止し、自分の周りの環境を調べること。一酸化炭素など無臭の有毒ガスが発生している可能性がある。風邪や疲れなどから来る頭痛であった場合でも、一旦実験を中止すること。疲れた状態、すなわち、判断力が低下した状態のままで実験を行うことは、大きな事故を招く原因となる。 If one develops a headache or does not feel well, such as lassitude, during the experiment, stop the experiment immediately and check the surroundings. It is possible that an odorless harmful gas, such as carbon monoxide, has been generated. Even if the headache comes from a cold or fatigue, stop the experiment at once. Continuing the experiment when tired may lead to a serious accident.
   

2.1.4. 電気を使用する器具

2.1.4 Apparatuses requiring electricity

(1) 濡れた手で触らない。感電する。 (1) Do not touch an apparatus with wet hands. Otherwise, you may get an electric shock.
(2) アースを取る。万一漏電していた場合、感電して危険である。 (2) Ground the apparatus. In the case of electrical leakage, there is a risk of an electric shock.
(3) 不用意に延長コードを使用しない。例えば、1500Wのインキュベーター(15 Aの電流が流れる)に6 Aしか容量のない延長コードを用いれば火災の原因になる(2.5.1.(4)参照)。 (3) Do not use an extension cord carelessly. For example, the use of an extension cord with a capacity of only 6 A for a 1500-W incubator (15 A of current passes) will cause fire (refer to 2.5.1(4)).
   

2.1.5. 退室時の注意

2.1.5 Precautions before leaving laboratory

(1) 後始末 (1) Cleaning up
自分が使用した器具、備品の後始末を行い、実験台を必ずその日のうちに責任を持って片付けること。また、退室することを同室の者に知らせる。 Clean the instruments and equipment used in the experiment, as well as the laboratory table. Inform the person staying in the laboratory about your leaving.
(2) 各部屋の最終退室者が確認すべき事項 (2) Points to be checked by the last person leaving the laboratory
1) ガス栓、湯沸し器  → 火災防止 1) Gas valves and water heaters are turned off. → to prevent fire
2) 終夜運転表示のない機器の停止。 → 火災防止と省エネルギー 2) Apparatuses that have not been marked for all-night running are turned off. → to prevent fire and save energy
3) エアコン、ストーブの停止。 → 省エネルギー、火災防止 3) Air conditioners and stoves are turned off. → to prevent fire and save energy
4) 出入り口、窓の施錠。 → 盗難防止 4) Doorways and windows are locked. → to prevent theft
5) 消灯。 → 省エネルギー 5) Lights are switched off. → to save energy
(3) 最終退出者への配慮 (3) Consideration for last person leaving laboratory
最終退出者の前の退出者は、最後に残る者に最終退出者となることを告げる。最終退出者となる者が希望する場合、最終退室者を援助すること。 The second to the last person leaving the laboratory has to inform the last person that he/she will be the last person in the laboratory. Be sure to help him/her if he/she wants.
   

2.1.6. 終夜運転

2.1.6 All-night running

(1) 使用者名、終了予定日時を表示する (1) Indicate user’s name and scheduled termination date and time
終夜運転を行う場合、使用者名、終了予定日時を必ず表示すること。最終退室者は、終夜運転の表示がない機器の電源を切る。電源を切られて実験が失敗しても、それは全て、必要な表示をしなかった実験者の責任である。 When running an apparatus all night, be sure to indicate the user’s name and scheduled termination date and time next to the apparatus. The last person leaving the laboratory has to turn off any apparatuses that have not been clearly indicated for all-night running. Even if the experiment fails as a result of the apparatus being turned off, the person who did not indicate the necessary information is responsible for the failure.
(2) 定常運転を確認する (2) Check steady operation
終夜運転を行う場合、その機械が定常に入るまで下校してはならない。目安として下校1時間前にはスタートし、設定電流(電圧)や設定温度に達するなどして定常運転に入ったことを必ず確認する。やむを得ない事情で下校する場合は、残っている者に確認を依頼すること。これは安全面だけでなく、実験を失敗しないためにも重要である。 When running an apparatus all night, do not go out until it becomes steady. Start running an apparatus one hour before going out, as a rough measure, and be sure to check that it is running in the steady state, that is, current (voltage) or temperature has reached the preset value. If you must go out unavoidably, ask someone staying in the laboratory to check the above. This is important not only for security but also for preventing experiment failure.
   

2.1.7. ストーブ、ガスバーナー

2.1.7 Stove and gas burner

(1) ストーブやガスバーナーの周囲に可燃物を置いてはならない。有機溶媒の容器を裸火のそばに置くのはもってのほかである。 (1) Keep flammable materials away from a stove or a gas burner. Never place any containers with organic solvents near an open flame.
(2) 部屋を無人にする場合、こまめにストーブ、ガスバーナーを消すこと。 (2) Switch off the stove or gas burner when leaving the laboratory.
(3) 有機溶媒を「持つ」時もストーブ、ガスバーナーなどの裸火を全て消すこと。ある大学で、有機溶媒の瓶を取り落として割れ、ストーブの火が引火して研究室が一つ丸焼けになった。貴重なデータ、研究試料は全て灰になり、何名かの学生は卒業が遅れた。有機溶媒を「使う」時だけではなく、「持つ」時も火気厳禁である。 (3) Even when just “holding” or “picking up” an organic solvent bottle, put out all open flames including that in the stove or gas burner. At a certain university, an organic solvent bottle was dropped and subsequently broke, resulting in one laboratory catching fire owing to a stove that had left on and being totally burned down. Some students did not graduate in that year because all the precious experimental data and research samples were burned to ashes. No flames are permitted not only when “using” organic solvent but also when “holding” bottles containing organic solvent.
   

2.1.8. 飲食喫煙

2.1.8 Food, beverages, and smoking

実験室内で飲食、喫煙、化粧は禁止。理由は、 Food, beverages, smoking, and cosmetics are prohibited in the laboratory, for the following reasons.
(1) 実験室では劇毒物、発ガン性物質、病原性微生物などを扱い、これらの経口吸収は非常に危険である。化粧はこれら有害物を肌の広い範囲に塗り広げる可能性がある。 (1) Poisonous and deleterious substances, carcinogens and pathogenic microorganisms are used in the laboratory, and are very dangerous when consumed. These harmful substances may be extensively spread on the skin by cosmetics.
(2) 食べこぼし、残飯は雑菌の巣になり、コンタミネーションの原因となる。 (2) Spilled food or leftovers become a breeding ground for bacteria and cause contamination.
   

2.1.9. タバコの吸い殻

2.1.9 Cigarette butt

実験室および廊下は禁煙。なお、灰皿の吸い殻を捨てる前には必ず水をかけること。消防庁の実験で、灰皿でタバコを消してから18時間後に出火した実例がある。消えているように見えても必ず水をかけてから捨てること。 Smoking is not allowed in the laboratory or the corridors. Be sure to pour water on cigarette butts in an ashtray before disposal. There has been a case of fire breaking out 18 hours after a cigarette butt was extinguished in an ashtray. Be sure to dispose of cigarette butts after pouring water even though they look extinguished.
   

2.1.10. 省エネルギー、節水、漏水

2.1.10 Energy saving, water saving and water leakage

(1) 長時間席を外す場合、パソコンは電源を切る。 (1) If you will be away from your desk for a long time, shut down the computer.
(2) 無人の部屋の照明、冷暖房は、特に理由がない限り、こまめに電源を切る。 (2) Turn off the lights and air conditioner in an unattended laboratory unless there is a special reason.
(3) アスピレーター(サッカー)の使用は避ける。
 節水のため、循環式水流ポンプ、ダイアフラム型ポンプ等を使用するよう心がける。
(3) Do not use the aspirator.
To save water, use the circulation water pump or diaphragm pump if possible.
(4) 冷却水を不必要に流さない。
 蒸留装置、ロータリーエバポレーター、ジャーファーメンターなどに冷却水を流す場合、過剰な冷却水を流さないように注意する。また、夜間は水道の使用量が減るので、水圧が上がることに注意すること。夜間の水圧上昇によって冷却水のホースが破れて(外れて)、階下まで水浸しになり、高価な機器が使用不能になった例がある。水道にホースをつなぐ際には必ず留め金をすること。
(4) Do not use cooling water carelessly.
If using cooling water in a distillation apparatus, a rotary evaporator and a jar fermenter, take care not to use too much. Also be careful of increased water pressure because water usage decreases at night. There has been a case of an expensive apparatus becoming unusable because the cooling water hose broke (disconnected from the faucet) and the downstairs was flooded when water pressure increased at night. Be sure to use a clamp when connecting the hose to the faucet.
(5) 逆浸透水の調製
 逆浸透水の製造装置は、逆浸透膜を洗浄するために逆浸透水20 L当たりドラム缶一杯の水道水が使われている。逆浸透水を無駄遣いすれば、その10倍の水道水を無駄遣いすることになる。
(5) Adjustment of reverse osmosis water
More than 200 L of tap water is used per 20 L of reverse osmosis water in the reverse osmosis water maker for washing reverse osmosis membranes. Waste of reverse osmosis water is equivalent to a 10-fold waste of tap water.
   

2.2. ガラス器具の取扱い

2.2 Handling and Cleaning of Glassware

研究におけるケガの原因で、ヤケドと並んで頻度が高いのがガラス器具による切り傷である。最悪の場合、腱や神経まで切断し、日常生活に支障をきたすこともある。「無理な力をかけるとガラスは割れる」ことを忘れてはならない。 Among many types of injury that may occur in the laboratory, laceration (cuts) from glass, in addition to burns, is the most frequent. At worst, tendons and nerves may be cut by glassware, causing interference with everyday activities. Do not forget that glassware is easily broken with the application of too much force.
   

2.2.1. 安全に関する一般的な注意事項

2.2.1 General safety precautions

(1) ヒビが入ったガラス器具は廃棄する (1) Dispose of cracked glassware
ヒビが入ったガラス器具は割れ易い。割れたガラスでケガをする危険があるだけでなく、有機溶媒や劇毒物などの危険物を撒き散らすことになる。見つけ次第、廃棄すること。 Cracked glassware should be handled with care. Broken glassware may not only cause injury but also spread dangerous substances, such as organic solvent and poisonous and deleterious substances. Dispose of them upon notice of cracks.
(2) 欠けたガラス容器は直ちに適正な処理をする (2) Immediately treat a broken glass container properly
ガラス容器の縁が欠けた場合、その場でヤスリをかけるかバーナーであぶって丸めること。放置すれば次に使う人がケガをする。 If the brim (rim) of the glass container is chipped, make the chipped area smooth by filing or heating in a burner. If it is left unfixed, the next user may be injured.
(3) 大容量の容器は原則としてプラスチック製を購入する (3) If a container with a large volume is necessary, use a plastic one as a rule
1 L以上のビーカー、メスシリンダーは破損しやすく、また高価である(表1参照)。有機溶媒を使用するなどの特別な事情がない限りプラスチック製のものを購入するべきである。 Beakers and measuring cylinders with a volume of 1 L or more are expensive and easily broken (refer to Table 1). Plastic containers should be used except under special conditions, such as during the use of organic solvent.
(4) 整理整頓 (4) Arrangement and organization
狭いスペースでの実験は、作業効率が悪いだけでなく、危険である。容器を倒して内容物をこぼしたり、ガラス器具を物品にぶつけて割ったり、実験台から落下させる原因となる。実験台は常に整理整頓し、十分な作業スペースを確保すること。 It is not only inefficient but also dangerous to carry out experiments in a small space. Samples may spill, or glassware may collide with other objects, break or fall from the laboratory table. Always keep the laboratory table neat and in order, and ensure sufficient working space.
(5) ひっかけ防止 (5) Prevention of glassware being knocked off tables
実験台などの端に物品を置いてはならない。通行の際にひっかけて落下し破損する。通行の際にひっかける可能性のある器具を見つけたら、そのつど安全な場所に移すよう心掛けること。 Do not place any objects at the corners of laboratory tables. When a person passes by, such objects may be caught, fall down and break. Try to move glassware, which has a possibility of being knocked off by a person passing by, to a safe place.
(6) 油性マジックで直接記入するのは避ける (6) Avoid directly writing on glassware with permanent markers
油性マジック(特に太いマジック)でガラス器具にサンプル名などを記入すると、洗浄しても消えにくく、無理に力を入れてこすれば破損してけがをする。ビニールテープなどを貼って記入する。やむを得ずマジックで記入した場合は、一晩水につけて落ちやすくしてから洗浄するか、エタノールやアセトンなどの溶媒で消してから洗浄すること。 If a permanent marker (in particular, a thick marker) is used for writing the sample name on the glassware, it is difficult to erase it even if washed and scrubbing with too much force may cause glassware breakage and injury to the person. Label with a vinyl tape and write the sample name on it. If something has been unavoidably written with a marker, dip the glassware into water overnight to easily remove the ink or erase it with solvent, such as ethanol or acetone, and then wash the glassware.
(7) スターラーのマグネットバーを入れる場合 (7) Placement of magnet bar of stirrer
ガラス容器にマグネットバーを入れる場合、容器を斜めにして滑らせるようにして入れる。スターラーには強力な磁石が入っているので、ガラス容器をスターラーの上に乗せてからマグネットバーを入れると、ガラス容器が強い衝撃によって割れてしまう。 When putting a magnet bar into a glass container, slide the magnet bar into the tilted container slowly. Because the stirrer contains a strong magnet, if it is put into the glass container after the container is placed on the stirrer, the container will be broken by the strong impact.
   

2.2.2. ガラス管のゴム栓への(ピペットのピペッターへの)挿入

2.2.2 Insertion of glass tube into rubber stopper (insertion of pipette into pipetter)

(1) 無理に狭い穴に太いガラス管を入れてはならない。 (1) Do not forcibly insert a thick glass tube into a small hole.
(2) ガラス管には水(事情が許せばワセリン)を付けて滑りを良くしてから挿入する。ただし、メスピペットをピペッターに挿入する場合、水やワセリンは使用しない。 (2) Insert the glass tube after putting water (vaseline can be used if circumstances allow) onto it for lubrication. However, water and vaseline should not be used to insert the measuring pipette into the pipetter.
(3) ガラス管の端から約2 cmの部分を、親指、人差し指、中指の3本で持ち、回しながら注意深く挿入する。 (3) Hold the glass tube with three fingers, that is, the thumb, index finger and middle finger approximately 2 cm from the tip, and insert the tube carefully and slowly while rotating it.
ガラス管の破損は、多くの場合、ゴム栓の根本、または、ゴム栓の根本から数cmの部位で起こる。ゴム栓から遠い位置を持ってガラス管を挿入すれば、ゴム栓部分を支点としてガラス管に大きな曲げ応力がかかる。5本の指でガラス管を握った場合、支点からさらに遠い薬指と小指の力によって曲げ応力はさらに大きくなる。また、5本の指でガラス管を握れば、ゴム栓部分を支点として、親指でガラス管を押し上げ、小指でガラス管を押し下げることになり、親指の位置にガラス管を折るには十分な力が加わる。そこで、ゴム栓から2 cm以内の位置を、親指、人差し指、中指の三指で持ち、薬指、小指を使わないようにすれば、ほとんどの破損事故は防ぐことができる。三指では力が入らないからと言って五指で挿入してはならない。三指で挿入できないのはゴム栓の穴が小さ過ぎるからであり、適当な径の穴を開け直すこと。 In most cases of breakage, the glass tube breaks at the base of the rubber stopper or a few cm from the base. If the glass tube is inserted while being grasped at a position far from the rubber stopper, a strong bending stress is applied to the glass tube around the rubber stopper section as a supporting point. If the glass tube is grasped with five fingers, bending stress is increased by the force applied by the ring finger and little finger, which are further from the supporting point. In addition, the glass tube is pushed up by the thumb and pushed down by the little finger around the rubber stopper section as a supporting point, and then receives sufficient force to break the glass tube at the thumb position. Therefore, grasp the glass tube at a position 2 cm or less from the rubber stopper with three fingers, that is, the thumb, index finger and middle finger and not using the ring finger and little finger, and almost all breakage can be prevented. Do not insert the glass tube with five fingers even though adequate force cannot be applied with three fingers. Difficult insertion with three fingers is due to the hole in the rubber stopper being too small. Therefore, enlarge the hole to an appropriate radius.
   

2.2.3. 大きなガラス容器、危険な試薬瓶は両手で持つ

2.2.3 Hold large glass container and dangerous reagent bottle with both hands

(1) 500 mL以上のビーカーを片手で鷲掴みしてはならない。溶液が入っているビーカーを片手でつかもうとすれば、その重さを支えようとして指が入る。この力でビーカーが割れる場合がある。筆者の知人はこれで指の神経を切断し、リハビリに1年近くかかった。 (1) Do not grab a beaker with a volume of 500 mL or more with one hand. If the beaker with solution is grabbed with one hand, it will have force applied on it by the fingers to support the weight. This force may break the beaker. An acquaintance of the author had a nerve in his finger cut, which required nearly a year for rehabilitation.
(2) ガロン瓶は両手で持つ。瓶の首に付いている取手だけを持って持ち運ぶと、瓶の重さで取手がもげることがある。取手は、持ち運びのためについているのではなく、内容物を注ぐときに瓶を傾けやすくするために付いていると考えよ。 (2) Hold a gallon bottle (3 L) with both hands. If the bottle is carried by grasping only the handle on the neck of the bottle, the handle may break off owing to the bottle’s own weight. Consider that the handle is attached not for carrying but for tilting the bottle when pouring the contents.
   

2.2.4. ガラス容器のフタが開かなくなった時

2.2.4 If lid of glass container cannot be opened

バイアル瓶、ネジブタ付き試験管など、ガラスが薄い容器は特に注意が必要である。「無理な力をかけるとガラスは割れる」ことを忘れてはならない。ガラス側を氷で冷やし、フタを暖めるなどして、無理なく開ける工夫をしなくてはならない。家庭にあるジャムなどの瓶は、力を入れても割れないようにガラスに十分な厚みをもたせてあるが、バイアル瓶、ネジブタ付き試験管などはガラスが薄く、力を入れれば破損する。 Take particular caution when handling thin-glass containers, such as vial containers and screw-top test tubes. Do not forget that the glass is easily broken by too much force. Think of a smart way to open the lid naturally, for example, cool the glass part of the container and warm the lid. Although common household jam jars have sufficient thickness so that they cannot be broken by force, vial containers and screw-top test tubes are made of thin glass that can be easily broken by force.
   

2.2.5. アンプルの開封

2.2.5 Opening of ampoule

アンプルに入っている試薬は、必ずそれなりの理由があってアンプルに入っている。酸素や水分を極端に嫌う、猛烈な臭気がする、蒸気が猛毒である、など必ず理由がある。まず、なぜアンプルに入っているのか、その理由を調べ、十分な準備をしなくてはならない。 There are several possible reasons for storing a reagent in an ampoule. For example, the reagent is very sensitive to oxygen or moisture, it has an extremely bad odor, or its vapor is extremely poisonous. First, know the reason why the reagent is stored in an ampoule and be sure to make adequate preparations for its use.
(1) 開封した試薬を使い切らないのであれば、まず、密封保存できる適当な容器を用意する。 (1) Prepare a sealable container with adequate volume if the reagent in the opened ampoule is not used up completely.
(2) 揮発性物質のアンプルの場合、氷水などで十分冷却し、水気を十分に拭き取る。 (2) In the case of a volatile substance, sufficiently cool its ampoule and wipe the moisture well.
(3) やすりで傷を入れる。 (3) Scratch the ampoule with a file.
(4) 折った時の勢いで手を切らないように注意して開封する。左手でアンプルを握り、折れたはずみで手を切らないように、右手で左手ごと握るようにして折る(左利きの場合は逆)。乾いた布などで包んでから折っても良い。 (4) Open the ampoule taking care not to cut one’s hand when breaking it. Grasp the ampoule with the left hand and break the ampoule with the right hand as if holding the ampoule and the left hand together (for a left-hander, reverse the hand). It is also better to break the ampoule wrapped in a dry cloth.
5 mL以上のアンプルの開封、及び危険な(毒物、特殊引火性物質、爆発性物質など)試薬の開封を行う場合、必ず十分な経験を持つ教員に指導を仰ぐこと。 When opening an ampoule with a volume of 5 mL or more or that with dangerous reagents (e.g., poisonous, special flammable and explosive substances), be sure to follow the instructions of a well-experienced instructor.
   

2.2.6. 破損時の後始末

2.2.6 Accidental Fall --- Cleanup of broken glassware

ガラス器具が破損した場合、素手での処理は極力避け、ほうき、掃除機を使用すること。破片は非常に危険なので完全に回収すること。また、溶液の入ったガラス器具を破損させた場合、こぼれた溶液は紙タオルなどで拭き取ること。雑巾を使用すると、目には見えなくても細かな破片が雑巾に残り、絞ったときに手を切る。 When glassware breaks, avoid cleaning the broken glass chips with bare hands as much as possible; use the broom or vacuum cleaner. Completely collect the broken glass chips because they are very dangerous. If glassware containing solution is broken, wipe the spilled solution with paper towel. Never use floor cloth. If a floor cloth is used, minute fine chips will remain on it that may cut the user’s hand when squeezing the cloth.
   

2.2.7. ガラス器具の取扱いに関するその他の注意点

2.2.7 Other precautions when handling glassware

(1) すり合わせのガラス器具 (1) Ground glassware
1) 本体と蓋の口径とピッチが合っていなければならない。すり合わせのガラス器具の本体と蓋には番号が付いており、同じ番号のもの同士でなければ密栓できない。 1) The bore and pitch of the body of a ground glassware must correspond to those of the lid. The body and lid have a number, which must be the same for sealing.
2) 乾いた状態で擦り合わせ部分を回してはならない。ガラスが削れ、密栓できなくなる。 2) Do not rotate the ground part under dry condition. Otherwise, the glass will be cut and cannot be sealed.
3) 保管の際には、乾燥後、本体と蓋の間に短冊状の紙をはさんでおく(抜けなくなる)。 3) When storing it, keep the reed-shaped paper between the body and lid after drying it (otherwise, the lid cannot be removed from the body).
4) アルカリ性溶液の保存に用いてはならない。ガラスがアルカリで溶着して開かなくなる。 4) Do not use it for storing alkali solutions. The glass will dissolve in the alkali solution.
(2) マジックで記入する場合 (2) When writing something with marker pen
白文字で印刷されている部分、及び曇ガラス部分には原則として記入しない。消えなくなる。 Do not write anything on the part printed with white characters or the fogged glass part as a rule. Otherwise, it cannot be erased.
(3) ラベル、マジックは必ず落とす (3) Be sure to remove the label and marker ink
ラベルをはったまま、また、マジックを落とさないまま乾熱器や乾燥器に入れると取れにくくなる。無理に取ろうとするとガラス器具の破損事故につながる。 If glassware with a label and marker ink is placed into a dry heater or dryer, it will become difficult to remove them. If the label is forcibly removed, it may cause the glassware to break.
(4) 目盛りの精度 (4) Accuracy of scale
メスシリンダーやメスフラスコなど、秤量に用いる器具を除いて、目盛りには5%以上の誤差のあるものも稀ではない。目盛付き試験管の精度もこの程度であるものが少なくない。精度が要求される実験に用いる場合、一定容量の水を入れて重量を測定するか、メスシリンダーやメスピペットで一定量の水を入れ、目盛りの精度を確認してから使用する。 Except for glassware used for measuring, such as measuring cylinders and measuring flasks, it is common for the scale to have an error of 5% or more. Many calibrated test tubes have an error to this extent. In experiments requiring accuracy, measure the weight of the glassware with a certain amount of water or check the accuracy by measuring a certain amount of water in a measuring cylinder or measuring pipette before use.
   

2.2.8. 洗浄の際の注意

2.2.8 Caution in cleaning

(1) 作業スペースを確保する (1) Secure work space.
洗浄作業をする場合、十分な作業スペースを確保する。少なくとも洗しの半分は何も置いていない状態にしてから(洗い物の一部をバットなどに入れて外に出してから)作業を始めること。 Secure sufficient work space when washing. Start washing after making at least half of the sink open (putting some of the instruments to be washed in a tray and taking them out from the sink).
(2) 洗しに器具を放置しない (2) Do not leave unwashed instruments in the sink
家事のプロは使った食器をすぐに洗う。これは使用した食器がひからびると汚れを落とすのに多大な労力を要するからである。直ちに洗浄できない事情があるのであれば、バットなどに入れて水に浸し、自分の実験台の上に置くこと。洗い場に放置すれば他の者に以下のような迷惑がかかる。 A professional housekeeper immediately washes the dishes used. This is because much labor is required to remove stains that have dried up on dishes. If for any reason you cannot immediately wash glassware, soak it in water in a tray and place it on your own laboratory table. If it is left in the common sink, you will inconvenience the next users for the following reasons.
1) 危険な試薬を扱った器具かどうか判断できない。
2) 洗浄スペースが確保できない。
3) 使いたい器具がない。
1) It cannot be determined whether the glassware was used with a dangerous reagent.
2) Sufficient space cannot be secured.
3) Necessary glassware is not available when needed.
(3) 流しにメスシリンダーを置く時は寝かせる (3) Lay down the measuring cylinder when placing it on the sink.
メスシリンダーは重心が高く、倒れて破損しやすい。流し場では必ず寝かせること。 The measuring cylinder, the center of gravity of which is at a high position, can easily fall down and break. Be sure to lay it down in the sink.
(4) マジックとテープは必ず落とす (4) Be sure to remove marker ink and tape.
マジックやテープを落とさないまま乾燥器(乾熱器)に入れると落ちなくなる。たとえ落とすことができても、それには多大な労力を要し、ガラスの破損事故にもつながる。 If glassware with marker ink and tape is put in a dryer (dry heater), the label cannot be removed after. Even if it can be removed, much force is required which may break the glassware.
(5) クレンザーを使用しない (5) Do not use cleansers
マジックを消す場合や、こびり付いた汚れを落とす場合などにクレンザーを使用してはならない。たとえクリームクレンザーであってもガラス面に微細なキズをつける。破損しやすくなるだけでなく、キズに付着した汚れは落ちにくく、実験精度に影響する。 Do not use a cleanser when removing marker ink or engrained stains. Even cream cleansers may cause fine cracks on the glass surface. In such a case, not only will the glassware become easily breakable but also the stain on the crack will be difficult to remove, influencing experiment accuracy.
(6) ブラッシングは十分に (6) Brush the instrument sufficiently
ブラシを2〜3度出し入れするだけでは洗ったことにならない。ブラシの形状を良く見て器具が十分にブラッシングされているか(特に、底の角の部分にブラシが届いているか)どうかを確認すること。ビーカーなど口の広い容器はスポンジを用いる。例えばリンの定量、フェノール硫酸法などによる還元糖の定量、蛍光分析などの微量分析には専用のガラス器具を用いるが望ましい。例えば、大きなステンレスなどの容器に入れ、0.5%程度の中性洗剤(アルカリ性の洗剤は不可)に浸してオートクレーブするときれいに洗浄することがきる。 Glassware cannot be completely cleaned by merely brushing it a few times. Check that the brush shape is appropriate for the glassware to be cleaned and check that the glassware is sufficiently brushed (in particular, that the bottom corners are properly brushed). Use a sponge for open-mouthed containers, such as a beaker. It is desirable to use special glassware for phosphorus determination, reducing sugar determination by the phenol-sulfuric acid method, and fluorometric microanalysis. For example, glassware can be thoroughly cleaned when it is placed in a large stainless-steel container, dipped in approximately 0.5% mild detergent (not alkali detergent) and then autoclaved.
(7) アルカリ洗剤に関する注意 (7) Precautions for alkali detergent use
アルカリ性の洗剤を用いる時は保護メガネと手袋を着用すること。また、強アルカリによってガラスは溶ける。アルカリ性の洗剤を用いる場合、長時間浸したり、不必要に加温すると、ガラス表面が溶けたり、微細なキズが入るので注意が必要である。 When using alkali detergent, wear protective glasses and gloves. Glass can be dissolved by a strong acid. If glassware is dipped into an alkali detergent or unnecessarily heated, the glass surface will melt and fine cracks will appear; therefore, exercise caution.
(8) ガラス器具は内面だけでなく外側も洗浄する (8) Wash not only the inside of glassware but also the outside
外面と口の部分はスポンジ等で洗浄する。口の部分には、付着した溶液が乾いて溶質がこびりついている可能性が高い。外面の汚れを落とさなければ、器具を逆さにして乾燥する際、外面を伝い落ちた水滴が器具の口を汚す。 Wash the outside and rim of glassware with a sponge. It is highly possible that a solution is dried up and solute is engrained around the rim. Unless stains on the outside are removed, the glassware rim will be contaminated by moisture rolling down the outside when it is dried upside down.
(9) すすぎ (9) Rinsing
すすぎはブラッシング以上に大切である。すすぎが不十分な場合、「洗剤で器具を汚す」ことになる。最低5回以上、試験管は10回以上すすぐことが望ましい。 Rinsing is more important than brushing. If the glassware is insufficiently rinsed, “it will be contaminated with detergent.” It is desirable to rinse it at least five times, in particular, at least 10 times for a test tube.
(10) 純水でリンスする (10) Rinse the glassware with pure water
試薬の調製に純水を使用しても、水道水で洗浄しただけの器具を使用したのでは意味がない。水道水で洗剤をすすいだ後、器具の内面だけでなく、外側も純水でリンスすること。 When preparing a reagent with pure water, there is no sense in using glassware rinsed with only tap water. Rinse the outside of the glassware as well as the inside with pure water after rinsing off the detergent with tap water.
(11) 床に水をこぼしたらすぐ拭き取る (11) If water is spilled on the floor, wipe it immediately
床が濡れていると滑って非常に危険である。すぐにモップなどで拭き取ること。 Wet floors are slippery and very dangerous. Immediately wipe the floor with a mop.
   
「ガラスは無理な力には耐えられない」、「割れたガラスは鋭利な凶器である」と言う常識を忘れた時に事故が起こる。例えば、 Accidents will happen if you forget the common sense that “glass cannot withstand too much force” and “broken glass is an edged weapon.” For example:
(1) ガラス管(ピペット)をゴム栓(安全ピペッター)に挿入する時(2.2.2.参照)。 (1) When inserting glass tubes (e.g., pipette) into rubber stopper (safety pipetter) (refer to 2.2.2).
(2) ビーカーを上から鷲づかみにした時(2.2.3.参照)。 (2) When grabbing beakers by their top (refer to 2.2.3).
(3) バイアルのフタを無理に開けようとした時(2.2.4.参照)。 (3) When forcibly opening lids of vial containers (refer to 2.2.4).
(4) 試料名をマジックで記入し、それをこすって落とそうとした時(2.2.7.(5)参照)。 (4) When scrubbing sample names written with a marker pen to remove it (refer to 2.2.7(5)).
(5) 割れたガラス器具を放置した時(2.2.1.(2)(3)及び2.2.6.参照)。 (5) When leaving broken glassware unattended (refer to 2.2.1(2),(3) and 2.2.6).
   

2.3. オートクレーブ

2.3 Autoclave

2.3.1. オートクレーブの構造

2.3.1 Autoclave structure

研究におけるケガで、ガラスによる裂傷に並んで頻度が高いのがヤケドであり、オートクレーブが絡んでいることが多い。オートクレーブは危険な作業であることを認識して使用すること。 Among the many possible injuries that can occur in the laboratory, a burn caused by the use of an autoclave is common as well as laceration from glass. Use the autoclave bearing in mind that its operation has risks.
生化学分野で最もポピュラーなオートクレーブの構造を図1に示す。タイマーで設定する時間は、設定温度に達した後、その温度を保つ時間(図2-A,Bの矢印の範囲)で、121℃10〜20分が標準である。 Figure 1 shows the structure of the most common autoclave in the field of biochemistry. The time to maintain the obtained temperature after the temperature reaches the set value (the range indicated by the arrow in Figs. 2(A) and (B)) is set on the timer and the standard time is 10 – 20 minutes at 121oC.
   

2.3.2. 使用手順

2.3.2 Operation

(1) カマの中に底板レベルまで水があることを確認する。 (1) Check that the autoclave is filled with water up to the bottom plate level.
(2) ドレインバルブが閉まっていることを確認する。 (2) Check that the drain valve is closed.
(3) フタを適度に締める。 (3) Fasten the lid moderately.
締めつけが緩ければ蒸気が漏れ、過度に締めればパッキンがすぐに劣化し、やはり蒸気漏れの原因になる。例えば、ハンドルを人差し指1本で回し、回らなくなったら両手でさらに1/4回転閉める、などのルールを決めておくと良い。 If the lid is fasten insufficiently, the vapor will leak, and if fastened too tightly, the packing will deteriorate fast, also causing vapor leakage. It is better, as a rule, to turn the handle using the forefinger to the end, and then fasten it by turning the handle by 90 degrees with both hands.
(4) 時間をセットして滅菌を開始する。 (4) Set the time and start the sterilization.
(5) 少なくとも70℃以下に下がるまで待つ(2.3.3.(2)-(3)を参照のこと)。 (5) Wait until the temperature decreases to at least 70oC (refer to 2.3.3(2)-(3)).
(6) 温度が70℃以下であり、かつ、圧力も0であることを確認する。温度計が壊れていて、吹き出した蒸気で上半身に大やけどを負った実例がある。必ず両方確認すること。 (6) Check that the temperature is 70oC or less and the pressure is zero. Actually, there was a case in which the thermometer was broken and the spewing vapor caused a heavy burn on the upper body of the victim. Be sure to check both values.
(7) 更に、ドレインバルブを開け、蒸気が出ないことを確認してからフタを開けること(ドレインバルブがない、あるいは開閉が自動で行われるオートクレーブもある)。 (7) In addition, open the drain valve and check that no vapor spews, and then open the lid (some autoclaves have no drain valve or automatic open and close system).
   

2.3.3. 安全上の注意

2.3.3 Safety precautions

(1) タイマーが切れるまで部屋を無人にしてはならない。パッキンの経年劣化などによって、蒸気が漏れた場合、空焚きになるからである。蒸気漏れがあれば、所定温度に達しないのでタイマーは進まず、加熱され続ける。最後には水がなくなり空焚きになる(図2-C参照)。タイマーが切れる前に帰宅してはならない。雑誌会やゼミなど、全員が部屋を空ける場合も同様である。空焚き防止センサーはいつも正常に機能する保証はなく、正常に機能するかどうかを確認することもできないので、過信してはならない。 (1) Do not leave the laboratory unattended until the timer cuts out. This is because no-water burning will be caused if the vapor leaks caused by the aged deterioration of the packing. If vapor leaks, the sample will continue to be heated up because the temperature cannot reach the set value and the timer cannot start. Finally, all of the water will be exhausted, causing no-water burning (refer to Fig. 2(C)). Do not leave the laboratory before the timer is shut off. This rule should be strictly applied when everyone leaves the laboratory for a magazine meeting or seminar meeting. Do not place too much confidence on no-water burning protection sensor because it is not assured to always correctly function and it cannot be checked whether the sensor correctly functions.
(2) オートクレーブした液体の実際の温度と温度計の表示にはズレがある(外側から冷えるので温度計部分が先に冷える)。寒天培地、消泡剤、高濃度の糖やグリセリンなどの粘度の高い液体、大容量の溶液などの場合、温度計の表示が80℃を切っていても、これらの溶液の実際の温度は100℃以上になっている場合がある(図2-D)。これを取り出せば突沸して火傷を負う。これらをオートクレーブする場合、温度計の表示が60〜70℃に下がるまで待つべきであり、また、取り出す際にも、突沸に備えた体勢で取り出し、取り出した直後に決して溶液を振り混ぜたりしてはならない。 (2) There is a deviation (difference) of the real temperature of the autoclaved liquid from the value indicated on the thermometer (the thermometer part is cooled earlier than the liquid because the outside of the autoclave is first cooled). The real temperature of agar medium, antiforming agent, highly viscous liquids, such as sugar at high concentration and glycerin, and a large amount of solution may be more than 100oC even though the thermometer indicates a temperature less than 80oC (Fig. 2(D)). When taking out such a sample, sudden boiling may occur, causing a burn. When it is autoclaved, wait until the value indicated on the thermometer decreases to 60 - 70oC, take it out to avoid sudden boiling, and never shake up the solution just after it is taken out.
(3) 寒天培地は容器の容量の1/2以上入れてはならない。例えば500 mL容の三角フラスコなら、上限は250 mLである。これ以上入れると突沸の危険が増し、オートクレーブ後に混ぜにくくなる(寒天は沈むのでオートクレーブ後の底の部分の寒天濃度は高い)。オートクレーブ直後に混ぜると突沸する危険がある。室温で数分程度放冷してから混ぜること。 (3) Do not put agar medium into a container exceeding half of its volume. For example, when using a conical flask with a volume of 500 mL, the agar medium limit is 250 mL. If more agar medium is used, the risk of sudden boiling increases, causing problems when mixing after autoclaving (the concentration of agar around the bottom after autoclaving is high because agar sinks). If agar is mixed just after autoclaving, sudden boiling may occur. Leave it to cool at room temperature for a few minutes.
(4) 有機溶媒など沸点の低い物質をオートクレーブしてはならない。場合によっては引火、爆発の危険があり、臭いで周囲に迷惑をかける。そもそも蒸発によって濃度が大きく狂ってしまう。 (4) Do not autoclave a sample with a low boiling point, such as organic solvents. To do so may cause fire or explosion; in addition, the bad smell produced will disturb others. The concentration of the sample will markedly change because of evaporation.
   

2.3.4. その他の注意点

2.3.4 Other precautions

(1) 器具をオートクレーブする場合、オートクレーブしても良いものであるかをカタログ等を調べて必ず確認すること。例えばギルソンのピペットマンはオートクレーブできない。プラスチック製の器具にもオートクレーブできないものは少なくない。 (1) If the apparatus is to be autoclaved, be sure to check that it can be autoclaved by referring to the catalogue and other information sources. For example, the Pipetman of Gilson cannot be autoclaved. Many plastic apparatuses cannot be autoclaved.
(2) 揮発性の強酸(塩酸、硝酸)はカマを痛める。適当な材質のフィルターで滅菌すること。 (2) A volatile strong acid (hydrochloric acid, nitric acid) can damage the autoclave. Sterilize it using a filter made of appropriate material.
(3) 強アルカリをオートクレーブすると容器のガラスが溶ける。何度も繰返しオートクレーブするとガラスは次第に薄くなり、破損事故につながる(ガラスの成分がアルカリに混入することに注意)。 (3) If a strong alkali is autoclaved, it will dissolve glass. If a glass container is repeatedly autoclaved many times, the glass will progressively become thinner, causing breakage (pay attention because glass components dissolve in alkalis).
(4) ジャーファーメンターをオートクレーブする場合、原則として60℃以下になるまでフタを開けない。大量の培地は冷えにくく、図2-Cのように突沸の危険があるだけではなく、圧力の変化でpHセンサー、溶存酸素濃度(DO)センサーを痛めることがある。 (4) If the jar fermenter is autoclaved, do not open the lid until the temperature decreases to 60oC or less as a rule. It is difficult to cool a large amount of medium and it not only has a risk of sudden boiling, as shown in Fig. 2(C), but also may damage the pH sensor and dissolved oxygen (DO) concentration sensor owing to the change in its pressure.
(5) オートクレーブする容器のフタは必ず緩めておくこと。密栓すると、昇温時には容器の外側の圧力が先に上がり、降温時には容器の外側の圧力が先に下がる。この圧力差によって、ガラス容器が割れる場合があり、プラスチックの容器は変形する場合がある。 (5) Be sure to loosen the lid of the container to be autoclaved. If sealed, the pressure outside the container increases prior to the inside as temperature increases, and decreases as temperature decreases. This pressure difference may cause the breakage of a glass container or the deformation of a plastic container.
(6) 遠心管などのプラスチック容器をオートクレーブする場合、多少フタを緩めていても、オートクレーブ後に冷えて中が陰圧になった時にフタが本体に密着し、さらに冷えて内圧が下がれば変形する。従って、フタを外して殺菌するか、フタを十分緩めた状態でアルミホイルを巻いてフタが本体に密着しないようにしてオートクレーブすること。 (6) If a plastic container, such as a centrifuge tube, is autoclaved, the lid will be pressed closely against the body when the container is cooled having a negative pressure after autoclaving, and will be deformed when the container is further cooled having a lower inner pressure. Therefore, sterilize the container with the lid removed, or wrap the container with aluminum foil while the lid is being sufficiently loosened so that the lid cannot be pressed closely against the body.
(7) 1気圧程度の圧力に耐える傷のないメジウム瓶などなであれば密栓してオートクレーブすることができるが、この場合、中に1滴蒸留水を入れておかなければ滅菌することはできない(乾燥状態での滅菌には160℃3時間程度を要する)。 (7) An uncracked medium bottle resistant to approximately one atmospheric pressure can be sealed and autoclaved. However, it cannot be sterilized unless a drop of distilled water is put in the bottle (it takes at least three hours at 160oC to sterilize the sample under a dry condition).
(8) 過度の加熱は試料を変質させる場合がある。例えば、酵母エキスとグルコースのように、アミノ基を持つ化合物と還元糖を同時にオートクレーブすると、メイラード反応が起こって培地は褐変し、場合によっては供試菌の生育を阻害する。この反応は加熱時間が長いほど、pHが高いほど(pH>6)顕著であり、また、少量の培地をオートクレーブした場合(図2-A)よりも大量の培地をオートクレーブした場合(図2-B)の方が顕著である。 (8) Overheating may transform the sample. If compounds with amino groups and reducing sugars, such as yeast extract and glucose, are autoclaved at the same time, the Maillard reaction occurs; therefore, the medium turns brownish and the sample strain may be prevented from growing. The longer the heating time and the higher the pH (pH>6), the more marked this reaction. Moreover, this reaction occurs more markedly when a large amount of medium is autoclaved (Fig. 2(B)) than when a small amount of medium is autoclaved (Fig. 2(A)).
(9) オートクレーブ内に試料をこぼした(吹きこぼれた)場合、洗浄しなければならない。また、こぼしていなくとも、通常は1週間に1回程度の水の交換、2〜4週に1回の洗浄が必要である。 (9) If the sample is spilled (boiled over) in the autoclave, clean it up. Even if no sample is spilled, change the water once a week and clean up the autoclave every two to four weeks.
   
オートクレーブによる事故例を挙げておく Examples of accidents caused by using the autoclave are as follows.
・ ビン状の容器に9割程度の寒天培地を入れてフタをしてオートクレーブ。90℃以下で取り出したが突沸してフタが飛び、顔面にヤケド。 • A bottle, 90% filled with agar medium, was autoclaved with the lid closed. When it was taken out at 90oC or less, sudden boiling occurred and the flying lid caused a burn on the face of the victim.
・ ジャーファーメンターを90℃以上で取り出し、突沸して上半身に大ヤケド(ケロイドが残った)。 • When a jar fermenter was taken out at 90oC or more, sudden boiling occurred, causing a heavy burn on the upper body of the victim (a keloid remains).
・ 消泡剤をフラスコでオートクレーブ。入れた容量は容器の1/4程度だったが、90℃近い温度で取り出した際に突沸し、手に全治1ヶ月のヤケド。 • An antiforming agent was autoclaved in a conical flask. Although the antiforming agent filled a quarter of the flask, sudden boiling occurred when it was taken out at nearly 90oC, causing a burn that required a month for recovery.
   
(1) タイマーが切れるまで部屋を無人にしてはならない。 (1) Do not leave the laboratory unattended until the timer shuts off.
(2) 70℃以下に下がるまでフタを開けない。 (2) Do not open the lid until the temperature decreases to 70oC or less.
(3) 70℃以下でも熱伝導の悪い(粘度の高い or 大量の)試料は突沸することがある。 (3) A sample with a low heat conduction (high viscosity or a large amount) has a risk of sudden boiling even at 70oC or less.
(4) 有機溶媒、強酸、強アルカリはオートクレーブしてはならない。 (4) No organic solvent, strong acid and strong alkali should be autoclaved.
   

2.4. 遠心分離機

2.4 Centrifuge

まず、下記の設問に答えてみよう(答えは次のページ)。 First, please answer the following questions (the answers are on the next page).
Q1.天秤でバランスをとれば形状の異なる遠心管を用いても良い。 Q1. Is it permitted to use a combination of differently shaped centrifuge tubes if they are balanced with the scale?
Q2.試料が1本の場合、同じ形状の遠心管に水を入れてバランスを取れば良い。 Q2. When there is only one sample, can the sample be balanced with another centrifuge tube of the same shape filled with water?
Q3.試料が1本の場合、同じ形状の遠心管に、試料と同じ比重のシュクロースなどの溶液を入れてバランスを取れば良い。 Q3. When there is only one sample, can the sample be balanced with another centrifuge tube of the same shape filled with a solution, such as sucrose, that has the same specific gravity as the sample?
Q4.室温で遠心分離する場合、冷却機のスイッチは入れなくても良い。 Q4. Is it unnecessary to switch on the cooler when centrifuging at room temperature?
Q5.遠心管の外側が濡れている場合、拭き取ってからバランスを合わせるのはなぜか? Q5. Why is the moisture wiped before balancing when the outside of the centrifuge is wet?
Q6.遠心分離中に試料が漏れた場合、どのような危険が生じるか? Q6. What might happen when a sample leaks from a tube broken during centrifugation?
Q7.使用後、ローターを伏せて置くのはなぜか? Q7. Why should the centrifuge rotor be left upside-down after use?
Q8.遠心機の蓋は、冷却状態での待機中は閉め、使用後は蓋を開けておくが、その理由は? Q8. Why is the cover of the chamber closed during cooling condition and open after use?
全問正解できただろうか? 遠心機は高速で回転し、その運動エネルギーも大きい。使用方法を誤ると、重大事故につながったり機械の寿命を著しく縮めことになる。以下に詳細を記すので正しい使い方を身につけ、その理由も十分に理解しておくこと。 Did you answer all the questions correctly? The centrifuge is rotated at a high speed and its kinetic energy is high. If used in a wrong way, a serious accident may result and the lifetime of the machine may be markedly decreased. Know the correct method of use and understand the reasons why such a method is used.
   
2.4.1. 最大回転数に関する注意 2.4.1 Precautions concerning maximum rotating speed
原則としてローターの最大許容回転数の8割以下で使用する。各遠心機のそれぞれのローターについて最大許容回転数が決っており、必ずそれを確認してから使用すること。どのような事情があろうと絶対に最大許容回転数を越えて使用してはならない。また、最大許容回転数はローターに汚れや傷がなく、機械を正しく使用し定期的なメインテナンスが行われていた場合の許容回転数である。従って、通常はその8割以内で使用するべきである。 Use a centrifuge at 80% or less of the maximum allowable rotating speed as a rule. Because each rotor of the centrifuge has a specified maximum allowable rotating speed, be sure to check the speed before use. Never use the centrifuge at a speed exceeding the maximum allowable rotating speed for any reason. The maximum allowable rotating speed indicates the allowable rotating speed of the rotor, which has no contamination or scratches, used correctly with regular maintenance. Therefore, normally use the centrifuge within 80% of the maximum allowable rotating speed of the rotor.
なお、回転数を2割減じた場合、遠心分離の時間を5割増せば、ほぼ同等の分離効果が得られる。 If the rotating speed is decreased by 20%, an almost equivalent centrifuging effect can be obtained by increasing the running time by 50%.
   

2.4.2. 遠心管についての注意

2.4.2 Precautions concerning centrifuge tube

(1) 許容遠心力、耐溶媒性を確認する。 (1) Check the allowable centrifugal force and proof-solvent performance
使用する遠心管がどれぐらいの遠心力に耐えるかを必ず確認すること。また、溶媒や強酸などを遠心分離する場合、遠心管の材質がそれに耐えるものであるかも確認しなければならない。表1及び以下のサイトを参照のこと(ブックマークに登録しておくと良い)。なお、許容される最大の遠心力は、ローターの形状と遠心管の形状がピッタリフィットする場合の値である。例えば、丸底のローターに先端が尖った遠心管を使用した場合、許容範囲内の遠心力でもその遠心管は破損する。 Be sure to check to what extent the centrifuge tube to be used can withstand centrifugal force. If solvent or a strong acid is centrifuged, also check whether the material of the centrifuge tube can withstand them. Refer to Table 2 and the web sites below (it is advisable to bookmark them). The allowable maximum centrifugal force is the value obtained when the rotor shape and centrifuge tube shape are properly fitted. For example, a centrifuge tube with sharp edge is used with a round-bottom rotor, the centrifuge tube may be broken even with centrifugal force within the allowable range.
http://www.hitachi-koki.co.jp/himac/support/m-tube.htm
各社遠心管の耐久性能

http://www.nalgenunc.co.jp/html/info.shtml
耐久性能、溶媒耐性、洗浄方法、滅菌方法

http://www.assist-sar.co.jp/
各種プラスチック製品の耐久性能
http://www.hitachi-koki.co.jp/himac/support/m-tube.htm
Endurances of centrifuge tubes made by several companies (in Japanese)

http://www.nalgenunc.co.jp/html/info.shtml
Endurance, proof-solvent performance, cleaning method, sterilization method (in Japanese)

http://www.assist-sar.co.jp/:
Endurances of several plastic products (in Japanese)
 
(2) 変形、ヒビのある遠心管を使用しない (2) Do not use a deformed or cracked centrifuge tube
遠心管は使用しているうちに必ず劣化する。変形やヒビが認められる遠心管は使用してはならない。なお、テフロン製の遠心管のように、少量の試料で遠心分離すると許容遠心力内で遠心しても変形するものがあるので注意すること(遠心管の8〜9割以上の溶液を入れなければならない)。また、ディスポーザブルタイプの遠心管はその名の通り、繰返し使用を前提にしていないので特に注意すること。 The centrifuge tube inevitably deteriorates as it is used. Do not use a deformed or cracked centrifuge tube. Note that some centrifuge tubes may be deformed when a small amount of sample is centrifuged even at less than the allowable centrifugal force, as is the case with Teflon centrifuge tubes (80 - 90% of the centrifuge tube must be filled with solvent). Note that a disposable centrifuge tube is not designed for repeated use, as its name suggests.
   
2.4.3. バランスに関する注意 2.4.3 Precautions when balancing
遠心分離を行う場合、重さのバランスではなく、モーメントバランス(重さ×重心の回転半径)が取れていなければならない。例えば、右図のように、同じ重さの粘土をヒモの中央に付けた場合(a)と先端に付けた場合(b)とを比べると容易に理解できる。ヒモを振り回した時に腕が感じる力は、(b)の場合の方が大きいのは明らかである。 For centrifugation, not weight balance but moment balance (weight× turning radius of center of gravity) is required. This can be easily understood by comparing the case of a piece of clay attached to the center of a string (a) with that of a piece of clay with the same weight on the end of a string (b) shown in Fig. 3. It is clear that the force given to the arm when swinging the string is higher in (b).
(1) 形状の異なる(重心の位置が異なる)遠心管同士ではモーメントバランスは取れない。 (1) There is no balance of moment between centrifuge tubes with different shapes (different centers of gravity).
(2) 比重1.2の溶液と、1.2倍容量の水(比重1.0)では、重量のバランスは取れてもモーメントバランスは取れていない(重心から回転軸までの距離が異なる)。 (2) There is a balance of weight but no balance of moment between a solution with a specific gravity of 1.2 and water with 1.2-fold volume (specific gravity: 1.0) (the distance from the center of gravity to the rotating axis is different).
(3) 例えば、比重1.2の菌体の50%懸濁液(懸濁液としての比重は1.1)を、比重1.1の食塩水でバランスを取った場合、遠心分離前のモーメントバランスは取れている。しかし、遠心分離後は比重1.2の菌体が管底に集中するので(重心が回転軸から遠ざかるので)、モーメントバランスを取ったことにならない。 (3) For example, when a 50% suspension of fungus with a specific gravity of 1.2 (gravity as a suspension: 1.1) is balanced using saline with a specific gravity of 1.1, there is a balance of moment before centrifugation. After centrifugation, however, the fungus with a specific gravity of 1.2 will be concentrated on the bottom of the tube (the center of gravity moves away from the rotating axis), meaning that there is no balance of moment.
(4) 遠心管の外側に水滴が付いた状態でバランスを取った場合、ローター内に水が結露している場合もバランスを取ったことにならない。 (4) If the centrifuge tube is balanced with the moisture on the outside of the tube or with water precipitated in the rotor, there is no balance, either.
フタも含めて同一形状(材質)の遠心管に同一試料を等分するのが正しいバランスの取り方である。実際には、比重に起因するモーメントのアンバランスはある程度許容される(例えば通常の大腸菌培養液のバランスを水で取る場合)。しかし、許容さける最大の回転数で分離する場合や、高濃度の硫酸アンモニウム、シュークロース、グリセリンなどの溶液や、高い濃度の菌体(細胞)懸濁液を遠心する場合などは、同一試料を等分してバランスを取らなければならない。 Correct balancing involves equally dividing a sample into centrifuge tubes of the same shape (material), the lid of which should also be of the same shape. The moment imbalance caused by the specific gravity is practically allowable to some extent (for example, the case that Escherichia coli culture solution is balanced with water). However, if a sample is centrifuged at the maximum allowable rotating speed, and ammonium sulfate, sucrose and glycerine solution at high concentration or a fungal (cell) suspension at high concentration are centrifuged, the same sample is equally divided for balancing.
   

2.4.4. 試料の漏れに関する注意

2.4.4 Precautions concerning sample leakage

アングルローターの場合、分離中の液面は鉛直(回転軸に対して平行)になる(図4-A)。液面が遠心管の縁を越えた場合、遠心管と蓋の密閉性が悪ければ試料は漏れる。試料が漏れれば、アンバランスが生じて機械やローターにダメージを与えるだけでなく、漏れた試料による生物的汚染(人体に有害な菌や、他の実験にとって有害なファージ)、化学的汚染(例えば発ガン物質や劇毒物)、腐食(例えば硫酸アンモニウムは放置するとアルミ合金ローターをひどく腐食させる)、最悪の場合は引火爆発(有機溶媒の場合)を引き起こす。 In the case of an angle rotor, the liquid surface becomes vertical (parallel to the rotational axis) during centrifugation (Fig. 4(A)). If the liquid surface is over the edge of the centrifuge tube, the sample will leak with poor sealing between the centrifuge tube and the lid. If the sample leaks, imbalance will result, which will not only damage the machine and rotor but also cause biological contamination (strain harmful to the human body and phage harmful to other experiments), chemical contamination (for example, carcinogens, and poisonous and deleterious substances), corrosion (for example, ammonium sulfate, if left, heavily corroding aluminum alloy rotors), and at worst, fire and explosion (in the case of organic solvent).
従って、蓋のシールが不完全な場合を想定して、回転時の液面が遠心管の縁を越える量を入れてはならない。特に、引火点の低い溶媒(例えばエタノール)を含む試料を遠心分離する場合、どのような事情があろうとも絶対に回転時の液面が遠心管の縁を越える量を入れてはならない。また、ヒビの入った遠心管、変形した遠心管は絶対に使用してはならない。もし危険な試料を漏らした場合、必ず教員に報告した上で対処すること。 Therefore, considering the case of the incomplete sealing of the lid, do not put a sample into a centrifuge tube so that the liquid surface during centrifugation is over the edge of the centrifuge tube. In particular, when a sample containing solvent with a low flash point (for example, ethanol) is centrifuged, never completely fill the tube to a level where the liquid surface during centrifugation (rotation) is above the edge of the centrifuge tube. In addition, never use a cracked or deformed centrifuge tube. If a dangerous reagent is spilled, be sure to report it to the instructor and then, treat the spill.
なお、試料を入れてフタをした遠心缶を指で押してみて洩れないからと言って蓋のシールが完全である保証はない。仮に図4Bで、液面が遠心管の縁よりも1 cm回転軸側にあったとする。1gでは10mの水柱の圧力が1気圧であるから、これを10,000gで遠心分離した場合、1 cmの水柱は10気圧の圧力に相当する。 Even if the sample does not leak when the closed centrifuge tube with the sample is pressed by the finger, there is no assurance that the lid has been sealed completely. Assume that the liquid surface is 1 cm nearer the side of the rotational axis from the edge of the centrifuge tube in Fig. 4(B). The pressure of a 10 m water column is 1 atmosphere under the condition of 1 g. In the case of centrifugation under the condition of 10000 g, the pressure of a 1 cm water column corresponds to 10 atmosphere.
   

2.4.5. 運転に関する注意

2.4.5 Precautions during operation

(1) ローターを確実に装着する (1) Attach the rotor completely
ローターの底部のツメと回転軸のツメがかみ合う方向を確認して、確実にセットしなければならない(ツメがない機種もある)。また、ツメを曲げたり折ったりしないように丁寧に扱わなければならない。セットした後、手でローターを軽く回して確実にセットされているかを確認すること。ローターのフタを締める際に何回まわすかを憶えておけば、正しくセットされていない時、いつもより回した回数が少ないので気付くことができる。 Check the meshing direction of the tab on the bottom of the rotor with that of the rotating axis, and then set the rotor completely (some centrifuges have no tabs). Take care not to bend or break the tab. After setting, check that the rotor is completely set by slightly turning it by hand. If you remember how many turns the lid of the rotor requires for fastening it, you can find the incorrect setting when you turn the lid less than usual.
(2) パッキンの装着を確認する。 (2) Check the attachment of packing
ローターとフタの間にはパッキンを装着しなければならない。ローターのフタのネジは、加速によって締まる方向に切ってある。逆に言えば、減速時には緩む(ローターは減速するが、フタは慣性で回り続けようとする)。パッキンの装着を怠れば、十分な締め付けが行えず、減速時にフタが緩んで外れる可能性がある。回転中にフタが飛べば、ほとんどの場合、多額の修理費用(数十万円以上)を要する。これが原因と推定される事故は、筆者の知る限りでも、当専攻で過去3件起きている。 Set the packing between the rotor and lid. The screw of the rotor lid is cut in the direction in which the screw is fastened by acceleration. Conversely, it is loosened when the rotor is decelerated (the rotor is decelerated, but the lid tries to rotate by inertia force). If packing is not correctly attached, the screw cannot be sufficiently fastened and the lid may become loose and fall off during deceleration. If the lid flies off during rotation, it is generally very expensive (more than a few hundred thousand yen) to repair it. There were three accidents presumed to result from such a default previously in our department to our knowledge.
(3) 定常運転に入るまで監視する。 (3) Monitor the centrifuge until the running state becomes steady.
回転が設定まで上がって定常に達するまでその場を離れてはならない。遠心管のセットミス、バランスの取り忘れ、遠心管の破損などがあっても、その場をはなれてしまうと対処できない。もし異常があった場合(異常な音がした場合)、直ちに停止スイッチを押すかタイマーをゼロにする。完全に停止するまで避難し、他の者を近づけないようにする。 Do not leave the centrifuge unattended until the rotating speed increases up to the preset value and becomes steady. Otherwise, appropriate action cannot be taken if there has been a mistake in setting the centrifuge tube or in balancing, or if breakage of the centrifuge tube should occur. If something abnormal (abnormal sound) occurs, immediately push the stop button or set the timer to zero. Take refuge and keep anyone away from the centrifuge until it completely stops.
(4) 運転中に絶対に蓋を開けてはならない。 (4) Never open the cover during running.
運転中に異音がした場合もあわてて蓋を開けてはならない。遠心管が破損していた場合、破片が高速で飛び散り、失明等の大ケガをする。 Do not open the cover carelessly during running even if there is an abnormal sound. If the centrifuge tube has been broken, the broken piece will scatter at a high speed and cause serious injury, such as blindness.
(5) 絶対に手でローターを止めてはならない。 (5) Never stop the rotor by hand.
巻き込まれて骨折等の重大事故につながる。回転軸が曲がり、遠心機の寿命を著しく縮める。「急ぐから」は全く理由にならない。心に余裕を持って完全に停止するまで待たなければならない。 The hand may get caught in the rotating rotor, causing a serious accident, such as a fracture. The rotational axis may be bent and the lifetime of the centrifuge may be decreased markedly. “Because I am in a hurry” is not a valid excuse. Be patient and wait until the centrifuge stops completely.
(6) 冷却機は常に電源を入れる (6) Always keep the cooler switched on
モーターの発熱、ローターと空気の摩擦による発熱によって温度は上がる。従って、室温で遠心する場合も冷却機の電源を入れておかなければならない。 The temperature of the centrifuge will be increased by the heat from the motor and from the friction between the rotor and air. Therefore, keep the cooler switched on even during centrifugation at room temperature.
(7) チャンバーの蓋 (7) Cover of the chamber
冷却機のスイッチが入っている時はチャンバー内での結露、氷結を防ぐために遠心機の蓋は閉めておく。逆に、冷却機のスイッチを切った時は、チャンバー内を乾燥させるために蓋を開けておく。極端な結氷があった場合、分離時の風圧ではがれて飛び散り、ローターやチャンバーにダメージを与える場合もある。 While the cooler is switched on, keep the lid of the centrifuge closed to prevent condensation and freezing in the chamber. Inversely, when switching off the cooler, open the lid to dry the inside of the chamber. If a large amount of ice is generated, ice crystals may fall off with draft pressure during centrifugation and scatter, damaging the rotor and chamber.
(8) 使用後のローターについて (8) Rotor after use
ローターを外して試料の漏れによる汚れがないことを確認する。外したローターは伏せて置いておくこと。これは、落下する埃や結露した水がローター内に溜まり、次回の遠心分離の際にバランスが崩れるのを防ぐためである。試料が漏れた場合、直ちに洗浄すること。ローターの汚れはバランスを崩すだけでなく、ローターを腐食させ、破損事故につながる。また、危険な試料(組換え生物、発ガン物質、劇毒物、腐食性物質、引火性物質など)を漏らした場合、必ず教員に報告した上で適切な対処をすること。 Remove the rotor and check that there is no contamination by possible sample leakage. Lay the removed rotor downward to prevent losing balance the next time centrifugation is carried out, owing to falling dust and condensed water collecting in the rotor. If the sample leaks, rinse the rotor immediately. The rotor contamination causes not only imbalance but also corrosion of the rotor and breakage. If a dangerous sample (recombined organism, carcinogen, poisonous and deleterious substances, corrosive substance, and flammable substance) leaks, be sure to report it to the instructor and then, treat the leakage properly.
   

2.4.6. 超遠心分離に関する注意

2.4.6 Precautions concerning ultracentrifuge use

(1) 教員立ち会いの元で使用すること (1) Use the ultracentrifuge in the presence of an instructor
超遠心分離機は、最大100,000 rpm前後の超高速で回転する。バランスの取り忘れや試料漏れを生じた場合、ローターが飛び大事故になるので特に注意が必要である。もし、ローターがチャンバーを突き破れば、ローターが高速で走り回り、実験室は壊滅する。通常の遠心機を普通車に例えるなら、超遠心機はF1マシンである。小さなミスでも重大事故に直結する。十分に習熟するまでは教員の立会いのもとで使用すること。教員に十分に習熟したと認められるまで単独で使用してはならない。 The ultracentrifuge rotates at an ultrahigh speed of around 100,000 rpm at maximum. Take special care as the rotor may fly out and cause a serious accident if balancing is forgotten or the sample leaks. If the rotor crashes through the chamber, the rotor will fly around the laboratory at a high speed and destroy the laboratory. If we consider the normal centrifuge as analogous to a normal car, the ultracentrifuge would be a racing car (F1 car). Even a small mistake may directly lead to a serious accident. Use the ultracentrifuge in the presence of an instructor until you acquaint yourself with its use sufficiently. Do not use it alone until you are recognized to be sufficiently familiar with its use by the instructor.
(2) プラスミド精製時の注意 (2) Precautions concerning plasmid purification
 プラスミドDNAを塩化セシウム−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離で精製する際、温度設定には十分注意すること。密度勾配が形成されると遠心管底部の塩化セシウム濃度は上昇するので、誤って4℃などに設定すると、底部で飽和濃度を超えて塩化セシウムの結晶が出来る。結晶の密度は溶液の密度よりも遙かに大きいのでモーメントバランスが崩れ、ローターが飛ぶ。プロトコールに示された温度と時間を厳守すること。 When purifying a plasmid DNA by cesium chloride – ethidium bromide equilibrium density-gradient centrifugation, take special care of the temperature setting. If a density gradient is formed, the concentration of cesium chloride at the bottom of the centrifuge tube will increase. Therefore, if the temperature is wrongly set at ‘4oC,’ the concentration of cesium chloride will exceed the saturated concentration and its crystal will precipitate. Because the density of the crystal is much higher than that of the solution, the moment balance will be lost and the rotor will fly out. Strictly observe the setting of temperature and time designated in the protocol.
なお、エチジウムブロマイドは発ガン物質であり、平衡密度勾配遠心分離には高濃度のものを使用する(RIよりも危険であると考えよ)。こぼした場合、必ず教員に報告し、適正に除染すること。特に地下の共通機器室のBeckmanの超遠心機の場合、遠心管のヒートシールの際に汚染しやすい。シーラーの使用前後に、備え付けのUVランプを用いて汚染の有無を確認すること。部屋を暗くして短波長の紫外線を当て、オレンジ色に光れば汚染している。ただし短波長の紫外線は肌に直接当てたり、裸眼で見たりしてはならない(2.7.参照)。 Ethidium bromide is a carcinogen and usually used at high concentration for equilibrium density-gradient centrifugation (consider that it is more dangerous than RI). If it is spilled, be sure to report it to the instructor and conduct proper decontamination. In particular, the Beckman ultracentrifuge in the common equipment room in the basement can become easily contaminated at the time of heat sealing the centrifuge tube. Check whether there is contamination using a built-in ultraviolet (UV) lamp before and after sealing. Under short-wavelength ultraviolet irradiation in a dark room, an orange glow indicates contamination. Of course, short-wavelength ultraviolet must not be irradiated directly onto the skin or looked at with the naked eye (refer to 2.7).
(3) ヒートシールについて (3) Heat sealing
遠心管の口を熱で融かしてシールする場合、遠心管の口に溶液が付着しているとシールが不完全になる(遠心力による内圧上昇→液漏れ→アンバランス→大事故)。取扱い説明書を熟読した上で、以下の点に注意してシールすること。 When sealing the centrifuge tube by melting its rim through heating, any solution adhering to the rim will cause incomplete sealing (increase in inner pressure by the centrifugal force → liquid leakage → imbalance → very serious accident). Carefully read the instruction manual and pay attention to the following when sealing.
1) 試料は図5のレベルまで入れる。これより多いとシールが不完全になりやすく、少ないと遠心力による圧力で遠心管が変形し、やはりアンバランスの原因となる。 1) Pour a sample up to the line shown in Figure 5. If a larger amount is poured, the tube will tend to be sealed incompletely, and if smaller, the centrifuge tube will be deformed by the pressure due to the centrifugal force, also causing imbalance.
2) 口に付着した試料溶液を、キムワイプのコヨリなどで完全に拭き取る。溶液が付着している部分はヒーターで加温しても温度が上がらないので(溶けないので)シールが不完全になる。口に付着した溶液が乾燥すると、溶液に含まれていた溶質がこびりついた状態で残るので、やはりシールは不完全になる。 2) Completely wipe the sample solution adhering to the rim of the tube with Kimwipe. Because the temperature at the part of the tube with the attached solution will not increase even when heated by a heater (the tube will not melt), the tube will be incompletely sealed. When the solution adhering to the rim dries up, the solute dissolved in the solution will remain in a dried-up state, also causing incomplete sealing.
   

2.4.7. スイング型遠心機(clinical centrifuge)に関する注意

2.4.7 Precautions concerning swing-type centrifuge (clinical centrifuge)

試験管を遠心分離できるスイング型の遠心分離機には、4つのアームに全て同じアセンブリーを装着して運転しなければならない。例え試料が1本(バランスを入れて2本)であっても、4つとも同じアセンブリーを装着しなければならない。一般に、1つに8本入る試験管用のアセンブリーを装着した場合の上限回転数は2,000 rpmである(機種によって異なるので必ず各自で確認すること)。 When running a swing-type centrifuge, in which the test tubes can be centrifuged, mount the same assemblies in all four arms. Even if centrifuging one sample (two samples for balancing), mount four identical assemblies. In general, when using an assembly in which eight test tubes can be placed, the maximum rotating speed is 2,000 rpm (be sure to check the value yourself because it depends on the type of centrifuge).
   
2.4.7. 遠心分離に関するknow how 2.4.8 Know-how for centrifuging
(1) 理論式から導けるコツ (1) Points for deriving the centrifugation effect from the theoretical formula
遠心分離の対象となる粒子のストークス半径と比重をそれぞれR及びr、回転速度をw、溶媒の比重と粘度をそれぞれr0及びh、回転軸から液面までの距離をrmin、回転軸から遠心管の底までの距離をrmaxとすれば、対象粒子の沈降に要する時間は

で与えられる。

Assuming that the Stokes radius and specific gravity of the particle to be centrifuged are R and, respectively, the rotation speed is , the specific gravity and viscosity of the solvent are 0 and , the distance between the rotational axis and the liquid surface is rmin, and the distance between the rotational axis and the bottom of the centrifuge tube is rmax, the time for the deposition of the objective particle is given as

1) 遠心分離の効果は、遠心力(回転数の2乗)と時間の積に比例する。従って、回転を1.2倍にすれば1.44倍の効果が得られる(ただし、最大許容回転数を厳守すること)。また、回転数を上げられない場合、時間を延長すれば良い。 1) The centrifugation effect is proportional to the product of centrifugal force (rotating speed squared) and time. Therefore, if the rotating speed increases by 1.2-fold, 1.44-fold the effect is obtained (here, strictly observe the maximum allowable rotating speed). If the rotating speed cannot be increased, rotation time can be increased.
2) 高濃度の塩や糖の溶液に含まれる粒子を遠心分離する場合、rr0が小さくなるので分離には時間がかかる。この時、溶液を薄めることが許されるのなら、水や緩衝液で希釈してから遠心分離すると良い。例えば、比重1.20の溶液中の、比重1.21の物質を分離する場合、比重の差は0.01だが、溶液を等量の水(比重1.00)で希釈して比重を1.10とすれば、比重の差は0.11となり、一桁短い時間で分離することができる。また、希釈は溶液の粘度を下げる効果もある。 2) When particles in a solution of salt or sugar at high concentration are centrifuged, it takes a long time to centrifuge because 0 is low. It is desirable to centrifuge such solutions after diluting with water or buffer solution if possible. For example, when a sample with a specific gravity of 1.21 in a solution with a specific gravity of 1.20 is centrifuged, the difference in specific gravity between the two is 0.01. However, if a solution is diluted to a specific gravity of 1.10 using an equivalent amount of water (specific gravity: 1.00), the difference in specific gravity will be 0.11 and the sample will be centrifuged for a time ten-fold shorter than the original. Moreover, dilution has an effect of decreasing the viscosity of a solution.
3) 溶液の温度が上がれば粘度は下がる。事情が許すなら、設定温度を上げたり、水で希釈すれば粘度が下がり、分離に要する時間を短縮することができる。 3) The viscosity of a solution decreases as its temperature increases. When increasing preset temperature or diluting a solution, the viscosity of the solution will decrease, which enables shortening of the centrifuging time.
4) rmax /rminが大きいスイング型のローターよりも、これが小さいアングル型のローターの方が早く分離できる。 4) Using an angle-type rotor with a low rmax/rmin, a sample is centrifuged more rapidly than when using a swing-type rotor with a high rmax/rmin.
(2) 沈殿の懸濁に苦労しているなら (2) If there are problems with suspension of precipitate
多くの場合、その回転数で分離することが目的ではなく、沈殿を回収するのが目的であるから、回転を下げてみると良い。また、沈殿の再懸濁の際、溶液を加える前に沈殿だけの状態でボルテックスミキサーにかけて沈殿を緩めておくと、懸濁が容易になる。 In most cases, the objective is not centrifugation at a given rotating speed but precipitate collection; therefore, it is desirable to decrease rotating speed. Moreover, when resuspending a precipitate, loosening (softening?) the precipitate to which the solution has not been added yet using a vortex mixer will facilitate suspension.
(3) ローターの予冷について (3) Precooling of rotor
使用する30分〜1時間前にローターを装着して温度を設定し、予冷しておくのが原則であるが、急いでローターを冷やしたい場合は、ローターと蓋を正しく装着した後、1,000〜2,000 rpm で 5〜10 分空回しをすると良い。 In principle, mount the rotor, set the temperature and precool it 0.5 – 1 hour before use. If the rotor is required to cool rapidly, it is desirable to properly mount the rotor and lid and then to idle the rotor at 1,000 – 2,000 rpm for 5 – 10 min.
通常の遠心分離機に関して About normal centrifuge:
(1) 重量ではなく、モーメントのバランスを合わせる。 (1) Balance the centrifuge with respect to moment not weight.
(2) 最大回転数を厳守し、通常はその8割以内で使用する。 (2) Strictly observe the maximum rotating speed and usually use the centrifuge at 80% or less.
(3) 遠心管はその遠心力、その溶媒に耐えられるかを確認する。 (3) Check that the centrifuge tube withstands the given centrifugal force and solvent.
(4) 試料の漏れ=危険(アンバランス、生物的汚染、化学的汚染、爆発火災事故)。 (4) Sample leakage = risk (imbalance, biological contamination, chemical contamination, explosion and fire).
(5) 冷却装置が付いていれば必ず使う。 (5) Be sure to use a cooling device if equipped.
(6) スイング型ローターには全てのアームに同じアセンブリーを装着する。 (6) Mount the same assemblies to all the arms of a swing-type rotor.
(7) 回転が定常に達するまで監視する。 (7) Supervise the rotor until its rotation becomes stable.
(8) 回転中はフタを開けない。 (8) Do not open the cover of the chamber during rotation.
(9) 手でローターを止めるのは言語道断 (9) Never stop the rotor by hand.
(10) もし試料が漏れていれば教員に報告する。 (10) Report sample leaks to the instructor.
超遠心分離機に関して About ultracentrifuge
(1) 十分に習熟するまで教官に立ち会ってもらう。 (1) Use an ultracentrifuge in the presence of an instructor until sufficiently acquainted with its use.
(2) 平衡密度勾配遠心の際には温度を厳守。 (2) Strictly observe temperature during equilibrium density-gradient centrifugation.
(3) エチジウムブロミドで汚染しないように細心の注意を払う。 (3) Take special precautions not to contaminate the sample with ethidium bromide.
   

2.5. 恒温槽

2.5 Thermostat Bath (Incubator)

普段何気なく使っている機械だが、火災などの大事故につながる危険がある機械である。当研究科でも、ウォーターバスの空焚き、オイルバスの加熱によるボヤ、乾燥機でプラスチックが融け異臭が立ちこめる発火寸前の事故が起きている。また、事故には至らなくても、正しく使用しないと正確に温度がコントロールできずに実験が失敗する。 The thermostat bath is generally used without special care but has a risk of causing large-scale accidents such as fires. In our department, there have been small fires caused by boiling the water bath dry and by heating of the oil bath, and foul odor emissions of melting plastic on the verge of fire in the dryer. An incorrect operation of the thermostat may cause inaccurate control of temperature, resulting in the failure of the experiment even though no accident is caused.
   

2.5.1. 共通注意事項

2.5.1 Basic precautions

(1) 終夜運転時の使用者名、終了予定日時の明記 (1) Display the user name and scheduled termination date and time for all-night running
終夜運転を行う場合、使用者名、終了予定日時を必ず明記すること。使用者名、終了予定日時が表示されていない機器は、最終退室者が電源を切ることとする。電源を切られて実験が失敗しても、それは全て、必要な表示をしなかった実験者の責任である。 When running the thermostat bath overnight, be sure to display the user name and scheduled termination date and time without fail. A bath left on without a display of user name and scheduled termination date and time must be turned off by the last person leaving the laboratory. Even if the experiment fails because the bath was turned off, the person who neglected to display the necessary sign must take full responsibility for the failure.
(2) 無人(終夜)運転時の注意 (2) Precautions concerning unattended (overnight) running
安全装置がついていない装置での無人(終夜)運転は禁止する。安全装置がついている機器であっても、温度コントローラーが常に正常に作動する保証はない。設定温度に達して定常に入ったことを確認しないうちは下校してはならない。やむを得ない事情で下校する場合は、他の者に確認を依頼すること。 Unattended (overnight) running without a safety device is prohibited. It is not guaranteed that the temperature controller will always function correctly even though it has a safety device. Do not leave until you confirm that the temperature has reached the preset value and that the bath is in the steady state. If you must leave, ask someone staying in the laboratory to perform the check in your place.
(3) 電源容量に関する注意 (3) Precautions concerning power source capacity
恒温槽は電力消費量が大きい(12〜20 A, 12〜20 kW)。電源の容量が十分かどうか確認すること。タコ足配線は厳禁である。 The thermostat bath has a large power consumption (12 – 20 A, 12 – 20 kW). Check that the power source has sufficient capacity. The use of socket multipliers is prohibited.
(4) 延長コードの使用について (4) Use of extension cord
容量が十分ではない延長コードを使用すると発熱し、火災の危険がある。原則として恒温槽に延長コードを使用してはならない。15 A以上の電流が流れる恒温槽も珍しくなく、延長コードを使用する場合、これに耐える十分な電流容量のコードを使用しなければならない(ちなみに、家庭用の延長コードは、6 Aしか容量がないものもある)。 If an extension cord with insufficient capacity is used, heat will be generated, which may cause fire. As a rule, extension cords should not be used for the thermostat bath. Because many thermostat baths require 15 A of current or more, if an extension cord must be used, ensure that it has sufficient capacity to accommodate such a current (for your reference, some household extension cords have only 6 A capacity).
(5) 制御部に水をかけてはならない (5) Do not wet the control unit
火災、感電の危険がある。また、回路がショートして恒温槽を壊す可能性がある。もし水がかかったら電源プラグを抜き(濡れた手で抜いてはならない)、可能な限り水を拭き取った後、メーカーに点検を依頼すること。 There is a risk of fire and electric shock. Moreover, the circuit may short out and the thermostat bath may be broken. If the control unit becomes wet, disconnect the plug of the power source (do not use wet hands), wipe up the water as much as possible, and request the manufacturer to inspect it.
(6) ベースヒーターとコントロールヒーター (6) Base heater and control heater
機種によってはコントロールヒーター(設定温度より上がれば切れ、下がれば入るヒーター)の他に、常に電流が流れるベースヒーターを備えているものがある。ベースヒーターは、温度を速やかに上げたい場合や、設定温度が高くてコントロールヒーターの能力が不足する場合にのみ使用するヒーターである。従って、通常の運転時にベースヒーターを使用すると温度はどんどん上昇し、実験が失敗するばかりでなく、火災の危険も出てくる。 Some thermostat baths are equipped with a base heater, in which current always flows, in addition to a control heater (the heater turns off when the temperature exceeds the preset value and turns on when below the preset value). The base heater is used only when a rapid increase in temperature is required and when the capacity of the control heater is insufficient to obtain a high preset value. Therefore, if the base heater is used during normal running, the temperature continuously increases, causing not only experiment failure but also a risk of fire.
(7) 温度計の精度 (7) Thermometer accuracy
温度計によっては2〜3℃狂っているものもある。一般に、化学反応(酵素反応)は温度が1℃上がれば6%早くなる。温度が重要な実験なら、用いる温度計の精度を標準温度計でチエックすること。なお、標準温度計は高価であるから、温度計のキャリブレーションにのみ使用し、通常の実験には使用してはならない。また、温度計の先端が恒温槽の壁面や底面に接していると正しい温度を測定できないので注意すること。 Some thermometers have an error of 2 – 3oC. In general, a chemical reaction (enzyme reaction) progresses 6% more rapidly as the temperature increases by 1oC. In an experiment in which temperature is an important factor, check the accuracy of the thermometer to be employed using a standard thermometer. Use the standard thermometer only for the calibration of the experiment thermometer and never in the experiment because it is expensive. Make sure that the end of the thermometer is not in contact with the wall or bottom of the thermostat bath, or the temperature will not be accurately measured.
   

2.5.2. ウォーターバスについて

2.5.2 Water bath incubator

(1) 終夜運転、無人運転についての注意 (1) Caution concerning overnight running and unattended running
空焚き防止装置が付いていないウォーターバスでの終夜運転を禁止する。また、昼間であっても無人で運転してはならない。毎回、空焚き防止装置が正常に作動することを確認してから使用すること。水位が低下してフロートが下がれば通電が遮断されるタイプの空焚き防止装置の場合、フロートに水垢が付着すると、フロートが動かなくなり、水位が低下しても作動しなくなる。フロート付近に汚れが付着しないよう、手入れを怠らないこと。 Never run a water bath overnight without the boil-dry protection device. Even in the daytime, unattended running is prohibited. At each use, check that the boil-dry protection device is functioning correctly before carrying out the experiment. In the case of the boil-dry protection device, which stops the current flow when the float descends to a certain level due to a decrease in water level, if water residue accumulates on the float, it will not move and will fail to function properly when the water level descends. Do not neglect the maintenance of the bath to prevent residue accumulation around the float.
(2) 水の補給 (2) Water supplement
インキュベーターの水は蒸発して減る。必ず十分な量の水を入れておくこと。室温と水温の差が大きく湿度が低い冬季は蒸発量が増えるので特に注意すること。終夜運転を行う場合、自動給水装置を工夫するか、アルミホイルや発泡スチロールで覆って蒸発を防ぐ工夫をすること。特に、高温で使用する場合、単位時間当たりの水位の低下を調べ、翌日登校するまで安全な水位が保てるかどうかを確認すること。なお、プラスチック球や発泡スチロールを水面に浮かべるのは危険。ヒーター部分に接触して発火する恐れがある。 Water in the incubator (thermostat bath?) evaporates. Be sure to maintain a sufficient amount of water in the bath. Because there is a large difference between room temperature and water temperature and a low air humidity in winter, pay particular attention to increases in evaporation. When running the bath all night, devise an automatic water supply system or prevent evaporation by covering the bath with aluminum foil. In particular, when using the bath at a high temperature, examine the water level decrease per unit time and check whether a safe water level can be maintained until your arrival at the laboratory the next day. It is dangerous to place plastic balls or foam polystyrene on the water surface. They may cause fire if they come into contact with the heater.
(3) 水位の確認 (3) Check of water level
最終退室者は、例え自分の実験でなくても、終夜運転しているウォーターバスの水位を確認し、十分でなければ補給すること。 The last person leaving the laboratory must check the water level of a water bath left to run overnight and add water if necessary even if it is not their own experiment.
(4) 安全装置を過信してはならない。 (4) Do not overly rely on the safety device
空焚き防止装置を備えた機種の取り扱い説明書には「毎回安全装置の動作の確認をすること」と明記されている。これを実行していない限り動作は保証されない。そもそも、安全装置が働けば電源が切れ、温度が保てなくなって実験は失敗する。例え安全装置が付いている機種であっても、水の補給に注意を払わなくても良い理由にはならない。 In the user instruction of the water bath equipped with the boil-dry protection device, there is a note “check the operation of the safety device at each use.” The operation is not assured unless checked properly. If the safety device is activated, the power will be shut off and the temperature will not be maintained, resulting in the failure of the experiment. The presence of a safety device is not an excuse to neglect the addition of water even for a water bath equipped with the safety device.
(5) 振盪時の注意 (5) Caution concerning shaking
振盪機の付いたウォーターバスを使用する場合、振盪によって水が飛散らないよう、水位や振盪速度を調整しなれればならない。特に無菌操作を必要とするサンプルを振盪する場合、ウォーターバスの汚い水(107/mL以上の雑菌がいても不思議ではない)が綿栓やシリコ栓にかからないような工夫をしなければならない。  When using the water bath with a shaking apparatus, adjust the water level and shaking speed so that water is not scattered during shaking. In particular, when a sample requiring sterilization is shaken, devise a way to keep dirty water (more than 107 bacteria/mL is not unusual) away from the cotton stopper and silicon stopper.
   

2.5.3. 孵卵器、乾燥器、乾熱滅菌器について

2.5.3 Incubator, dryer and dry heat sterilizer

(1) 孵卵器、乾燥機、乾熱滅菌は防爆構造ではない (1) The incubator, dryer and dry heat sterilizer have no explosion-proof construction.
有機溶媒、可燃性ガス等は絶対に入れてはならない。 Never put organic solvent or flammable gas into them.
(2) 乾熱滅菌器には可燃物を入れてはならない。 (2) Do not put any flammable materials into the dry heat sterilizer
プラスチック、紙などの可燃物は乾熱滅菌器に入れてはならない。綿栓のみ例外とする。 Do not put combustible material, such as plastic and paper, into the dry heat sterilizer. The only exception is the cotton plug.
(3) 温度設定ダイヤルはテープなどで固定する (3) Fix the temperature setting dial with tape
温度設定がダイヤル式の恒温槽は、物品などが当たって設定温度がずれないようにテープを貼ってダイヤルを固定すること。当専攻で、設定がずれてプラスチック器具が融けた実例がある(幸い、異臭で気づいて火災には至らなかった)。 If the thermostat bath has a temperature setting dial, fix the dial with tape so that the preset temperature cannot be shifted by contact with other materials. In our department, there has been a case in which a plastic instrument melted due to an inadvertent shift of the temperature dial (fortunately, fire was prevented because of detection of a foul odor).
(4) 乾燥機、乾熱滅菌機に器具を入れる場合、その器具がその温度に耐えられるかを必ず確認する (4) Check that any instrument used in the
一般にプラスチック器具(ピペットマン等も含む)は乾熱滅菌の温度(160℃)には耐えない。チップ、エッペンドルフチューブ、プラスチックビーカーなどを乾熱滅菌すれば、溶けて高温のヒーター部分に流れ込んで発火し、火災につながる。 dryer or dry heat sterilizer can withstand the preset temperature
In general, plastic instruments (including the Pipetman) cannot withstand the temperature in the dry heat sterilizer (160oC). If a chip, Eppendorf tube or plastic beaker is dry-heat-sterilized, it will melt and flow into the high-temperature heater, causing a fire.
(5) 空気循環を妨げてはならない (5) Do not block air circulation
ファンの吹出し口にサンプルや器具を置いてはならない。また、庫内に大きな物品を入れたり、物品をぎっしり入れてはならない。一般に温度センサーは庫内の上部に、ヒーターは下部に設置されているが、空気の循環(対流)が妨げられると、温度がコントロールできなくなる。上部の温度が設定温度に達しなければヒーターの通電が続き、下部は高温になる。これによってプラスチック器具が融け、赤熱したヒーター部分に流れ込んで出火した実例がある。 Do not place the sample or instruments on the outlet of the fan. Do not place large objects in the machines and do not fill the machines with too many objects. In general, the temperature sensor is installed in the upper part of the machines and the heater in the lower part. If the air circulation (convection) is prevented, the temperature cannot be controlled. The heater continues working until the temperature in the upper part reached the preset value, which causes the temperature in the lower part to become too high. There has been an incident of fire due to a plastic instrument melting in the high-temperature heater and flowing into the heater part.
(6) 底板を外してはならない (6) Do not remove the bottom plate
庫内の底部に敷かれている板は、高温になる底板と物品を隔離し、空気循環を確保するためのものである。背の高い試料を入れたいからと言って底板を外してはならない。火災事故の原因となる。 The board at the bottom of the machines separates the bottom plate, the temperature of which will become high, and the sample to ensure air circulation. Do not remove the bottom plate even when attempting to put in a tall sample. Otherwise, fire may result.
(7) 試料をこぼした場合 (7) When the sample is spilled
孵卵器内に試料をこぼした場合は必ず直ぐに拭き取らなくてはならない。腐敗してコンタミの原因になる。 If the sample is spilled into the incubator, wipe it off immediately. Otherwise, it may corrode the incubator and cause contamination.
   
共通 Basic precautions
(1) 終夜運転時には氏名と終了予定時刻を明記する。 (1) Display the user name and scheduled termination time for overnight running.
(2) 安全装置がついていない機器では無人(終夜)運転禁止 (2) Unattended (overnight) running of the machines without the safety device is prohibited.
(3) 温度が定常になったことを確認する。 (3) Check that the temperature has attained the steady state.
(4) タコ足配線厳禁。 (4) Never use a socket multiplier.
(5) 延長コード使用時は電気容量に注意。 (5) Pay attention to the electric capacity when using an extension cord.
(6) 制御部は水厳禁。 (6) The control unit must be kept dry.
ウォーターバス Water bath
(1) 水の量は十分か(水なし+機能しない安全装置=火災)。 (1) Is the amount of water sufficient?
(No water + nonfunctional safety device = fire)
(2) 毎回、空焚き防止装置が正常に機能することを確認する。 (2) At each use, check that the boil-dry protection device functions correctly.
(3) 最終退室者は自分の実験でなくても水量を確認する。 (3) The last person leaving the laboratory must check the water level regardless of whose experiment it is.
孵卵器、乾燥器、乾熱滅菌器 Incubator, dryer and dry heat sterilizer
(1) 溶媒、可燃性ガスを入れてはならない。 (1) Do not use organic solvent or flammable gas.
(2) 庫内の空気循環を妨げない。 (2) Do not block the air circulation in the machines.
(3) 乾熱滅菌器は可燃物厳禁。 (3) Do not place combustible material in the dry heat sterilizer.
   

2.6. 減圧操作

2.6 Reducing Pressure

2.6.1. 装置に関する注意

2.6.1 Cautions concerning apparatuses

(1) 水流ポンプでベンゼンや含ハロゲン溶媒を吸引してはならない。 (1) Do not draw up benzene or halogen-containing solvent directly with the water-jet pump.
ベンゼンや含ハロゲン溶媒(クロロホルム、ジクロロメタン、クロロエチレン)などを水流ポンプで吸引してはならない。下水に含ハロゲン溶媒が流れ、環境を汚染する。循環式水流ポンプであっても吸引してはならない(循環式水流ポンプの水を交換する時、含ハロゲン溶媒を含む水を下水に流すことになる)。 Do not draw up benzene or halogen-containing solvent (chloroform, dichloromethane and chloroethylene) with the water-jet pump. Otherwise, halogen-containing solvent will be discharged into the sewage and cause environmental contamination. Neither should they be drawn up with the circulation water-jet pump (when replacing water in the circulation water-jet pump, water with the halogen-containing solvent will be disposed of into the sewage).
(2) 真空ポンプで酸性のガスを直接吸引してはならない。 (2) Do not draw up acidic gas directly with the vacuum pump.
例えば塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などはポンプ内部を腐食させ、機械の寿命を著しく縮める。テフロンコートした特別なポンプを用いるか、水酸化ナトリウムなどを入れたトラップを使用すること。 For example, hydrochloric acid, acetic acid and trifluoroacetic acid will corrode the inside of the pump and considerably reduce its lifetime. Use a special Teflon-coated pump or a pump with a trap containing sodium hydroxide or other chemicals.
(3) オイル式真空ポンプで有機溶媒及び水溶液を直接吸引してはならない  (3) Do not draw up organic solvent or solution directly with the hydraulic vacuum pump.
酸性ガスほどではないが、ポンプの寿命を縮める。また、吸入した溶媒や水の蒸気圧のため、十分な真空度が得られなくなる。液体窒素かドライアイス−エタノール(メタノール)などを用いたコールドトラップを通して吸引すること。水溶液の場合、シリカゲルカラムで代用することもできる。この場合、シリカゲルは色が変ったら(赤みを帯びてきたら)交換しなければならない。 Organic solvent and solution are less detrimental than acidic gas, but also reduce the lifetime of the pump. In addition, a sufficient vacuum level cannot be attained because of the vapor pressure of the drawn solvent or water. Draw them up through a cold trap cooled with liquid nitrogen or dry ice - ethanol (methanol). If drawing up a solution, the silica gel column can be used alternatively. In this case, replace the silica gel when its color changes (the gel becomes tinged with red).
(4) 真空を破ってからポンプを停止する (4) Break the vacuum condition before stopping the pump
ポンプを停止させる場合、3方コックを使うかホースを外すなどして、減圧を破ってから停止させる。真空ポンプの中には逆流防止弁が付いていないものもあり、減圧を破る前にポンプを止めるとオイルが逆流し、試料がだめになる(後始末も大変)。水流ポンプには通常、逆流防止機構は付いていない。手順を誤ると水が逆流して大切な試料がだめになる。特に、デシケーターなどで減圧乾燥を行う場合、逆流した水が乾燥剤(五酸化リン、塩化カルシウム、濃硫酸など。シリカゲルも例外ではない)と激しく反応して事故の原因となる。なお、そもそも減圧乾燥に水流ポンプを用いるのは間違いである(水流からの水蒸気のため厳密な乾燥はできない)。 Before stopping the pump, break the vacuum condition by using the three-way cock or detaching the hose. Some vacuum pumps have no backflow valve. If such a pump is stopped before breaking the vacuum, oil will flow back and ruin the sample. (Cleanup is very difficult.) The water-jet pump normally has no backflow prevention valve. If it is operated incorrectly, water will flow back and ruin the valuable sample. In particular, for drying at a low pressure with a desiccator, backflowing water will react strongly with the drying agent (phosphorus pentoxide, calcium chloride, concentrated sulfuric acid, etc; silica gel is no exception), causing an accident. In fact, the use of the water-jet pump for drying at a low pressure is incorrect (the sample cannot be dried completely because of the vapor from the water flow).
   

2.6.2. 減圧操作に関する注意事項

2.6.2 Notes on operation for reducing pressure

(1) 減圧する容器は減圧に耐える容器でなければならない (1) A container exposed to a low pressure must be resistant to a low pressure
減圧ビン、吸引ビン、デシケーターなど減圧を前提にした肉厚の容器しか減圧してはならない。また、ヒビやキズがないかどうかを毎回確認してから使用すること。三角フラスコなどは減圧すると割れると考えよ。破片や内容物が激しく飛散り、非常に危険である。 Use only thick containers designed for use under a low pressure, such as a pressure-reduction bottle, an aspiration bottle and a desiccator. Before each use, check that the bottle is not cracked or chipped. Be aware that a conical flask may break when the pressure is reduced. The broken pieces of the flask and contents scatter violently, which is very dangerous.
(2) 即座に突沸に対応できなければならない (2) Be ready for quick response to sudden ‘boiling’
溶媒を減圧する場合、突沸した時、即座に減圧を中止できるように、三方コックなどを取り付けておくこと。特に、減圧を開始した直後、試料を加温し始めた時、試料の溶媒がなくなる直前は突沸しやすいので、常に監視し、突沸した時にすぐにそれに手をかけておくなどの工夫をしなければならない。減圧を始めてすぐにその場を離れるのは言語道断である。 When reducing the pressure of the solvent, attach a three-way stop cock to the pump to enable immediate cessation of pressure reduction in the event of sudden boiling. Sudden boiling tends to occur particularly just after starting pressure reduction, when starting heating of the sample, and just before the sample solvent is completely exhausted. Therefore, always monitor the pump and be prepared to take immediate action, such as by keeping the hand on the stop cock, in the event of sudden boiling. Never leave the pump unattended just after starting pressure reduction.
   

2.6.3. ロータリーエバポレーター

2.6.3 Rotary evaporator

(1) 排気は徐々に注意深く  (1) Start the exhaust slowly and carefully
発泡や突沸が起った場合に直ちに減圧を破れるようにコックに手を掛けながら排気を始める。減圧を始めてすぐにその場を離れるような非常識なことをしてはならない。 Start the exhaust, keeping the hand on the stop cock to immediately break the vacuum condition in the event of bubbling or sudden boiling. Never leave the pump unattended just after starting pressure reduction.
(2) 通常は真空ポンプを使用しない (2) Do not regularly use the vacuum pump for pressure reduction
通常は水流ポンプを用い、真空ポンプは使用しない。真空ポンプを使用する場合、先に述べたように液体窒素かドライアイス−エタノール(メタノール)で冷却したトラップを通すこと。 Generally use the water-jet pump, not the vacuum pump. If using the vacuum pump, draw up solutions through the trap cooled with liquid nitrogen or dry ice – ethanol (methanol), as noted above.
(4) 十分に減圧が安定するまで加熱してはならない (3) Do not heat until the pressure has become sufficiently low and stable
十分減圧となり発泡も突沸も起こらなくなってから加熱する。 Start heating after a sufficiently steady low pressure is obtained and no bubbling or sudden boiling occurs.
(5) 冷却水の水流停止は火災事故につながる (4) Stopping the flow of cooling water may cause fire
減圧を始めてから5分後、及びその場を離れる時には冷却水が十分流れているか確認せよ。溶媒が回収されずに排気され、爆発や火災につながる場合がある。 Check that sufficient cooling water flows, 5 minutes after starting pressure reduction and at the time of leaving the evaporator unattended. The solvent may be not collected but exhausted, which may cause explosion and fire.
(1) 減圧することを前提に作られた容器を使う。 (1) Use a container designed for use under a low pressure.
(2) ロータリーエバペレーターの冷却水停止は爆発火災事故につながる。 (2) Stopping the flow of cooling water in the rotary evaporator causes explosion and fire.
(3) 乾燥剤+水の逆流=危険 (ポンプを止めるのが最後) (3) Drying agent + backflow water = danger (stop the pump after all operations)
(4) 水流ポンプは含ハロゲン溶媒、ベンゼン厳禁 (4) The use of benzene or halogen-containing solvent with the water-jet pump is prohibited.
(5) 真空ポンプには適当なトラップを付ける。 (5) Attach the proper trap to the vacuum pump.
   

2.7. 紫外線ランプ

2.7 Ultraviolet Lamp

紫外線、特に、短波長の紫外線は人体に有害である。また、DNAを染色して観察する場合、短波長の紫外線はDNAにチミンダイマーの形成、切断などのダメージを与える。 Ultraviolet radiation, in particular, short-wavelength ultraviolet radiation, is harmful to the human body. When staining and observing DNA, short-wavelength ultraviolet radiation will damage the DNA, for example, by causing thymine dimer formation and DNA breakage.
(1) ランプを点灯させる際には短時間であっても必ず保護メガネを着用すること。 (1) When turning on the lamp, even for a short time, always wear protective glasses.
(2) アガロースゲルからのDNA断片の回収など、数秒間以上の作業を行う場合、長袖の服(白衣)と手袋を着用し、フルフェイスのフェイスマスクを着用すること。 (2) For operations taking more than a few seconds, such as collecting DNA fragments from agarose gel, wear long-sleeved clothes (lab coat), gloves and a full-face mask.
(3) クリーンベンチなどに取り付けられている紫外線ランプは有害な短波長(通常245〜254 nm)のランプが使われている。紫外線はガラス、アクリル板で遮蔽できるが、直接肌に浴びたり裸眼で見たりしてはならない。なお、トランスイルミネーターに用いられている長波長ランプ(通常312〜365 nm)とは異なるので、交換の際に混同しないように注意すること。 (3) The ultraviolet lamp attached to the clean bench emits harmful short-wavelength (normally 245 – 254 nm) ultraviolet radiation. Although ultraviolet radiation can be blocked by glass or acrylic plates, direct exposure of the skin or direct viewing with the naked eye must be prevented. Furthermore, it differs from the long-wavelength lamp (generally 312 – 365 nm) used in the transilluminator. Care must be taken not to mistake them when exchanging the lamp.
(4) 波長の切り替えが可能なトランスイルミネーターの場合、DNA断片の切り出しには長波長側を用いること(切り替えスイッチの表示がH, Lとなっている機種の場合、これは出力の高低ではなく、波長の高低を意味することに注意せよ)。 (4) When using the transilluminator, the wavelength of which can be varied, set the switch to the long wavelength for DNA excision (pay attention to H and L on the selector switch, which refer not to the output power but to the wavelength).
   

2.8. 試薬の取り扱い

2.8 Handling Reagent

試薬を取り扱う場合、必ず保護メガネを着用すること。万一危険な試薬(溶液)が目に入った場合、直ちに(数秒以内に)多量の水で15分以上洗浄した後、医師による処置を受けること。特に、アルカリや有機溶媒などが目に入った場合、寸秒を争って洗浄すること。洗浄が一秒遅れるごとに失明のリスクが増す。また、早く医師の診察を受けるよりも、十分に洗浄することが重要である。 When using reagent, always wear protective glasses. If you get dangerous reagent (solution) in the eye, immediately (within a few seconds) wash the eye with generous amounts of water for more than 15 minutes, and consult a physician. In particular, if you get alkali or organic solvent in the eye, wash the eye vigorously without delay. Every second you delay the higher the risk of blindness. It is more important to sufficiently wash the eye than to quickly consult a physician.
実験で試薬を使用する際には、全て、取り扱い上の注意を理解してから使用しなければならない。また、「実験を安全に行うために」(化学同人)などの手引書を読んでどのような物質がどのように危険なのか、事故の時どのように対処すべきかと言ったことに関する一般的な基礎知識を持っていなければならない。更に、使用する個々の試薬について、メルクインデックスなどを調べ、例えば以下の点に関して十分な予備知識を持っていなくてはならない。 Before using reagent in your experiment, understand the handling instruction for all reagents. Refer to a textbook, such as “Carrying Out Experiments Safely” (KAGAKU-DOJIN) to acquire general basic knowledge about “what substances are dangerous in what ways,” and “what should be done in the event of an accident.” In addition, consult the Merck Index and make sure to acquire sufficient background knowledge for each reagent to be used with respect to, for example, the following points:
(1) どの程度人体に害があるのか、 (1) How harmful is the reagent to the human body?
(2) 引火、爆発の危険はないか、 (2) Are there any risks of fire or explosion?
(3) こぼした時の処理はどのようにすれば良いのか、 (3) What procedure should be followed when the reagent is spilled?
(4) 廃液の正しい処理方法 (4) Proper method of treating waste liquid
(5) 正しい保存方法(冷蔵、冷凍、遮光、窒素置換など) (5) Proper storage method (refrigerating, freezing, protecting from light, nitrogen substitution, etc.)
   

2.8.1. 取扱に注意を要する試薬の例

2.8.1 Examples of reagents to handle with care

今まで何気なく使っている試薬の中にも意外に危険な試薬がある。以下に身近な実例、及び、めったに使わないが特に注意を要する試薬についてその例を示す。 Some reagents, which are normally used without special care, may be unexpectedly dangerous. Some familiar examples and reagents which are rarely used but should be handled with special care are given below.
(1) 特殊引火物  (1) Special flammable substances
エーテルなどが該当する。消防法では最高ランクの危険度であり、部屋中の裸火を消してから取扱わなければならない。ここで言う取扱いは、溶媒ビンを「持つ」ことも含む(2.1.2.参照)。着火温度が極めて低く、引火しやすい。また、一度引火すると爆発的に広がり消化が困難であり、十分な注意が必要である。なお、これらの溶媒の遠心分離はいかなる事情があっても厳禁である(防爆型の特殊な遠心分離機が必要で、当専攻にはない。)。 Ether is an example. According to the Fire Defense Law, its danger level is ranked the highest, and therefore, all open flames in the room must be extinguished before it can be handled. Here, “handling” includes “holding” the solvent bottle (refer to 2.1.2). Ether is flammable because of its extremely low ignition temperature. Once the ether catches fire, the fire expands explosively, which is difficult to extinguish, and therefore, utmost caution is required. The centrifugation of these solvents is strictly prohibited (a special explosion-proof centrifuge, which is unavailable in our department, is required).
(2) 高引火性物質 (2) Highly flammable substances
エタノール、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、アセトン等がこれに該当する。特殊引火物同様、取り落として割れた場合を考え、ビンを「持つ」時はストーブなどの裸火を全て消すこと。また、水溶性の溶媒であるからと言って流しに廃棄するのは危険である。液の表面積が広くなるので溶媒蒸気の量が増え、湯沸かし器の火、遠心機のモーターの火花などで引火、爆発する可能性がある。 Ethanol, methanol, acetonitrile, hexane and acetone are examples. Similar to special flammable substances, extinguish all open flames, such as that in a stove, before “holding” the bottle, in case the bottle is dropped and broken. It is dangerous to dispose of these solvents in a sink even though they are soluble. Because the amount of solvent vapor increases with liquid surface area, these solvents may catch fire from the water heater or a spark from the motor in the centrifuge and explode.
(3) 毒劇物 (3) Poisonous and deleterious substances
シアン化カリ、シアン化ナトリウム、アジ化ナトリウム、水銀化合物、砒素化合物など。他にフェノール、クロロホルム、アクリルアミド、硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アセトニトリルなどもこれに該当する。施錠できる専用保管庫に保管し、台帳を作成して重量管理しなければならない。また、紛失、台帳への記入漏れに気づいた場合、直ちに教官に報告しなければならない。 Potassium cyanide, sodium cyanide, sodium azide, mercury compounds and arsenic compounds are examples. Phenol, chloroform, acrylamide, sulfuric acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide and acetonitrile are also examples. Store them in their designated lockable storage cabinet and manage their mass by preparing a log. Upon recognizing a lost or incomplete form in the log, immediately report it to the instructor.
毒劇物を購入し、納品されたら、忘れずに台帳へ記入すること。また、研究室間での貸し借りは必ず教員の了承を得ること。 When the ordered poisonous and deleterious substances are delivered, be sure to record them in the log. When borrowing or lending such substances between laboratories, be sure to obtain approval from the instructor.
(4) その他、身近な危険物 (4) Other familiar dangerous substances
・過酸化水素水 • Hydrogen peroxide solution
金属が混入すると爆発的に反応する場合がある(小中学校の理科の実験で行った過マンガン酸カリウムを触媒に過酸化水素水から酸素を発生させる実験を思い起こしてみると良い)。微量の錆が混入して爆発事故が起きた例もある。金属の容器や注射器などを絶対に用いないこと。 If metal is mixed into this solution, it may react explosively (recall the science experiment to generate oxygen from hydrogen peroxide solution using potassium permanganate as a catalyst, performed in elementary and junior high schools). There has been a case of explosion due to the contamination of a small amount of rust. Never use a metallic container or injector.
・過硫酸アンモニウム • Ammonium persulfate
ポリアクリルアミドゲルの重合開始剤として用いられるが、これも希ではあるが金属と爆発的に反応する場合があるので秤量の際には金属製の薬サジを用いてはならない。プラスチックまたは竹の薬サジを用いる。ポリアクリルアミドゲルの調製に用いるなら以下の方法を推奨する(多少割高だが、電気泳動用の10%溶液も市販されている)。 This is used as a polymerization initiator of polyacrylamide gel. Because it occasionally may react explosively with metal, do not use a metallic medical spoon when weighing the ammonium persulfate. Use a plastic or bamboo spoon. When using the ammonium persulfate for the preparation of polyacrylamide gel, the following procedure is recommended (10% ammonium persulfate solution for electrophoresis, although slightly more expensive, is commercially available):
1) 1 g単位で購入する。 1) Purchase ammonium persulfate in units of 1 g.
2) 純水3〜5 mLを試薬瓶に直接加えて溶解する。 2) Add 3–5 mL of pure water directly into the reagent bottle and dissolve the ammonium persulfate.
3) 15 mL容のディスポーザブルチューブに移し、その目盛りで10 mLにメスアップする。 3) Transfer the solution into a disposable tube with a volume of 15 mL and dilute to 10 mL.
4) 1回で使い切る100〜500 Lの適当な単位でエッペンドルフチューブに分注する。 4) Dispense an amount suitable for one-time use in the range of 100 – 150 L into several Eppendorf tubes.
5) -20℃以下で冷凍保存する。 5) Store it in the freezer below –20oC.
多くのプロトコールでは過硫酸アンモニウムは使用時調製となっているが、分注して冷凍保存すれば全く問題ない。また、この方法で調製する場合の誤差は、アクリルアミドゲルの重合開始剤として用いる場合、問題にならない。 In most protocols, ammonium persulfate should be prepared at the time of use. However, there is no problem with the use of ammonium persulfate dispensed from a stock kept in the freezer. The error in the preparation by this method does not cause any problem when using ammonium persulfate as a polymerization initiator of acrylamide gel.
・アクリルアミド • Acrylamide
神経毒である。肌に付いた場合、直ぐに洗えば問題ないが、放置すれば麻痺することもある。 This is neurotoxic. If it comes in contact with the skin, no problem arises if the skin is washed immediately, but it may cause paralysis if the skin is left untreated.
・フェノール • Phenol
腐食性物質であり、皮膚につけば火傷を負う。核酸の抽出を行う際の注意点を2.8.6.に示す。 This is a corrosive substance. If it comes in contact with the skin, it causes burns. Precautions during the extraction of nucleic acid are given in 2.8.6.
・クロロホルム  • Chloroform
劇物、腐食性物質、特定有害物。皮膚につけばフェノールほどではないが火傷を負う。長期にわたって吸入すれば肝臓癌になるとされている。必ずドラフト内で使用すること。核酸の抽出を行う際の注意点を2.8.6.に示す。 This is deleterious and corrosive and is designated as a specified toxic substance. If it comes in contact with the skin, although less harmful than phenol, it may still cause burns. Chloroform is considered to cause liver cancer if inhaled over a long period. Be sure to use it within the draft chamber. Precautions during the extraction of nucleic acid are given in 2.8.6.
・エチジウムブロマイド、ニトロソグアニジン、エチル(メチル)メタンスルホン酸 • Ethidium bromide, nitrosoguanidine, ethyl (methyl) methane sulfonate
強力な発癌剤である。アイソトープよりも危険であると考えよ。取扱いに十分習熟するまでは教員の指導の元で使用すること。また、こぼした場合の対処方法や廃棄する場合の処理方法を熟知していなければならない。2.8.4.及び2.8.5.を参照のこと。 These are highly carcinogenic agents. Consider them more dangerous than isotopes. Use them under the instructor’s guidance until you acquire full handling expertise. Ensure full knowledge on the treatment for spills and the disposal method. Refer to 2.8.4 and 2.8.5.
・五酸化リン、生石灰(酸化カルシウム)、濃硫酸、シリカゲル • Phosphorus pentoxide, quicklime (calcium oxide), concentrated sulfuric acid, silica gel
乾燥剤としても用いられるこれらの試薬は水と激しく反応する。シリカゲルでさえ水につければ弾けて危険である。デシケーターの内容物を廃棄する場合、十分な注意が必要である。 These are also used as drying agents and reagents of these four substances react violently with water. Even silica gel is dangerous because it bursts upon contact with water. Exercise sufficient caution when disposing of the contents of a desiccator.
   

2.8.2. 購入時の注意事項

2.8.2 Cautions in purchasing

(1) 購入しようとする試薬に関する正しい知識を持つ (1) Acquire proper knowledge about the reagent to be purchased
メルクインデックス等で必ず使用する試薬についての知識を持つ。これは上に述べたような毒性や爆発性などに関する正しい知識を得るためだけでなく、実験を失敗しないためにも必要である。例えば、難溶性の試薬の水溶液の調製方法(pHを少し変えたり、一旦他の溶媒に溶かす)や、試薬の安定性など、有益な情報を得ることができる。 Be sure to acquire knowledge about the reagent to be used, using information sources, such as the Merck Index. It is necessary not only to obtain the proper knowledge concerning toxicity and explosiveness but also not to fail in the experiment. For example, useful information, such as the preparation method of the solution of a difficult-to-dissolve reagent (shifting its pH slightly or dissolving it initially in another solvent) and the stability of the reagent, can be obtained.
(2) 必要最低限の単位で購入する (2) Purchase the reagent only in the smallest necessary amount
試薬の廃棄には、購入時の何十倍、何百倍もの費用がかかることも珍しくない。大量に買って余らせれば、それ自体もったいないだけでなく、余分な廃棄費用が必要になることを認識しておくこと。 It is not uncommon for a reagent disposal fee to be tens or hundreds of times more expensive than the purchasing cost. Recognize that the remains of excessive purchases are not only wasteful but require additional disposal fees.
保存によって劣化する試薬も少なくない。特殊な保存方法が要求される試薬(吸湿性試薬、アンプル入り試薬、遮光、窒素置換、冷蔵、冷凍保存などを必要とする試薬)は、必要最小限の単位で購入すること。例えば、1 g瓶と10 g瓶が市販されており、実験に2 g必要であれば、1 g瓶を2本購入する方が結果的に安上がりになる場合も多い。 Many reagents deteriorate in storage. Purchase reagents requiring special storage methods (hygroscopic reagent, reagent in ampoule and reagents to be protected from light, stored under nitrogen, refrigerated or frozen) in only the smallest necessary amounts. For example, 1-g bottles and 10-g bottles are commercially available; if 2 g of the reagent is required, it is often less expensive to purchase two 1-g bottles than one 10-g bottle.
   

2.8.3. 使用時の注意事項

2.8.3 Precautions for use

(1) ラベルの確認 (1) Label check
誤った試薬を使わないようにラベルを3回確認する。1回目は試薬棚から出す時(探す時にラベルを見るはず)、2回目は秤量する時(複数の試薬瓶を天秤のそばに持って行ったら、秤量する時にもう一度見るはず)、3回目は試薬棚に戻す時(元あった場所に戻すために試薬のラベルを見るはず)。以下に間違い易い例を挙げておく。 Check the label three times so as not to use an incorrect reagent. First check: when retrieving the reagent bottle from the reagent cabinet (always check the label). Second check: when measuring the reagent (if placing numerous reagent bottles together near the balance, always check the label before measuring the reagent). Third check: when returning the bottle to the reagent cabinet (always check the label when replacing the bottle back on the shelf). The following are examples of commonly confused reagents.
1) リン酸、クエン酸、EDTA、ATPなどの多価アニオン 1) Polyvalent anions, such as phosphoric acid, citric acid, EDTA and ATP
例えば、4価のEDTAの場合、free acid, 1〜4ナトリウム塩の5種類がある。リン酸にはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などがそれぞれ3種類ある。 For example, tetravalent EDTA has five types of salt, namely, free acid and 1 – 4 (monovalent – tetravalent?) sodium salt. Phosphoric acid has several salts, such as sodium salt, potassium salt and ammonium salt, and each salt has three types.
2) 結合水の数 2) Number of bonded water molecules
例えば、Na2HPO4の場合、無水物、7水塩、12水塩の3種類がある。モル濃度の場合、それぞれの分子量を用いれば秤量すべき量を計算できるが、重量濃度の場合、どの塩を用いるかで濃度は異なるので注意すること(実験ノートには用いた試薬の結合水の数も正確に記録する)。 For example, Na2HPO4 has three types of salt, namely, anhydride, heptahydrate and dodecahydrate. For mol concentration, the amount to be measured can be calculated from each molecular weight. However, note that the weight concentration is different depending on the type of salt used (the number of bonded water molecules in the reagent used must be accurately recorded in the experiment note).
(2) こぼした場合 (2) If reagent is spilled
秤量時に試薬をこぼしたら必ず後始末をすること。放置すれば、次に別の試薬を秤量する際に、こぼれていた試薬は薬包紙の裏に付着して混入する。こぼした試薬の素性を知っているのは、こぼしたあなただけであり、放置すれば適切な後始末ができなくなる。 If the reagent is spilled during measurement, be sure to clean it up. Otherwise, the spilled reagent will come into contact with the back of the powder paper and contaminate the next reagent being measured. Only the person who spilled the reagent knows its identity. If left untreated, it cannot be properly cleaned up.
(3) 薬サジ (3) Medical spoon
秤量に使用する薬サジは必ず良く洗って純水でリンスしたのち、完全に乾燥させたものを用いる。濡れた薬サジを使用すれば試薬が湿気て劣化を促進する場合もあるし、正確に秤量することができなくなる。極微量の不純物のために失敗する実験も少なくない。なお、過硫酸アンモニウムなど、金属製の薬サジを使用してはならない場合があるので注意すること(2.8.1.(4)参照)。 Before using the medical spoon to measure reagent, ensure that the spoon is washed well, rinsed with pure water and dried completely. If a wet medical spoon is used, the reagent may deteriorate due to moisture, and will not be measured accurately. It is not uncommon for experiments to fail because of a very slight amount of impurity contamination. Note that a metallic medical spoon should not be used for some reagents, such as ammonium persulfate (refer to 2.8.1(4)).
(4) 試薬は必ず元に戻す (4) Be sure to return the reagent
使用した試薬は必ず直ちに元あった場所にラベルを手前に向けて戻す。ラベルが剥がれかかっていたり、消えかけていれば、貼りつけたり、改めて記入したりと言った適切な処置を取らなければならない。内容物が不明の試薬の廃棄には非常に高額の費用を要する。 Be sure to immediately return the reagent used with the label facing forward. If the label is peeling off or worn away, take proper steps, such as reattachment or rewriting of the name. It is highly expensive to dispose of reagents containing unknown substances.
(5) 冷蔵、冷凍していた試薬の開栓 (5) Opening container of refrigerated or frozen reagent
冷蔵あるいは冷凍保存している試薬を使用する場合、必ず室温に戻してからフタを開ける。冷えている状態のままフタを開けると空気中の水蒸気が結露して試薬が湿気てしまう。湿気れば劣化を促進するし、もはや正確に秤量することができなくなる。なお、短時間室温にさらすことによる試薬の劣化は、湿気た状態で長期間低温保存する際の劣化に比べて無視できる。ただし、以下の(6)と(7)は例外である。 When using a reagent stored in a refrigerator or a freezer, be sure to bring it to room temperature before opening the lid. If the lid of a cold bottle is opened, vapor in the air will condense, making the reagent wet. When wet, the reagent may deteriorate and will no longer be measured accurately. The deterioration of a cold reagent, caused by exposure to room temperature for a short time, is negligible compared with that caused by storing under a wet condition at a low temperature for a long time. However, (6) and (7) are exceptions.
(6) アンモニア水、過酸化水素水、腐敗した糖液 (6) Ammonium water, hydrogen peroxide, corrosive carbohydrate solution
アンモニア水、過酸化水素水などは瓶の中が高圧になっている場合がある。気温が高い時は氷水などで冷却してから蓋を開けるべきである。なお、密封された容器の中で糖を含む培地が腐敗し、炭酸ガスで内部が高圧になっている場合、不用意にフタを緩めると爆発的に飛び散ることがあるので注意すること。何れの場合も必ず保護メガネを着用すること。 The pressure in a bottle of ammonium water and hydrogen peroxide may be high. If the temperature in the bottle is high, cool it with ice water before opening the lid. When a medium containing sugar corrodes in a sealed bottle and the pressure within a bottle filled with carbon dioxide is high, be aware that the contents may scatter explosively if the lid is carelessly loosened. Always wear protective glasses without fail.
(7) アンプルの開封 (7) Opening an ampoule
アンプルを開封する場合は氷水などで冷却してから開ける。その実験で使い切らない場合、密閉保存できる適当な材質と大きさの容器を用意してから開封する。アンプルに入っている試薬は、それなりの理由(例えば、酸素や水分を極端に嫌う、悪臭がするなど)があってアンプルに密閉されているのだから、開封後も密閉して保存しなければならない。なお、パラフィルムには通気性があるので密封したことにはならないことに注意。 Open an ampoule after cooling it with ice water. If the total amount of reagent is not used in the experiment, prepare a container of suitable volume and material and which can be sealed, before opening the ampoule. Because there is a reason for sealing the reagent in an ampoule (for example, extreme sensitivity to oxygen or moisture, or a foul odor), it must again be sealed for storage after opening. Note that Parafilm cannot be used to seal an ampoule, because of its breathability.
   

2.8.4. 発癌性物質の取扱い

2.8.4 Handling of carcinogens

エチジウムブロマイド、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸などの物質は強い発ガン性があり、こぼして放置すれば、例え微量であっても、本人はもちろん、関係者全員を長期に渡って危険にさらすことになる。こぼした場合の検出が難しいため、アイソトープよりも危険だと考えるべきである(エチジウムブロマイドは紫外線を当てれば検出できる)。使用する場合は例えば以下のようにアイソトープと同様に(アイソトープ以上に)細心の注意が必要である。なお、使用する試薬、実験目的によって使用手順は異なるので、必ず教員の指導の元で実験を行うこと。 Ethidium bromide, nitrosoguanidine, ethyl (methyl) methane sulfonate are highly carcinogenic and should even a slight amount of these substances be spilled and left untreated, all those present, not just the experimenter, will be exposed to long-term risk of disease. Consider these substances more dangerous than isotopes because spilled substances are difficult to detect (ethidium bromide can be detected by ultraviolet irradiation). When using these substances, as with the case of isotopes (or more than with isotopes), exercise particular caution, as described below. Be sure to use them under the instructor’s guidance because procedures differ depending on the reagent and the experimental aim.
(1) 必ず手袋と保護メガネを着用する。決して素手で扱ってはならない。なお、使用した手袋は汚染しているものとして取扱い、手袋をしたまま不用意に物品に触ってはならない。 (1) Always wear protective glasses and gloves. Never treat these substances with bare hands. Consider used gloves to be contaminated, and do not carelessly touch other materials when wearing gloves.
(2) 秤量の際は教員に立ち会ってもらうこと。微量でもこぼさないように細心の注意を払う。 (2) Request the presence of the instructor when measuring these substances. Take sufficient care not to spill any amount of the substance.
(3) 試薬瓶は新しい透明な袋に入れて口を閉じて保管する。 (3) Store the reagent bottle in a transparent plastic bag with the top closed.
(4) 試薬が入っていた古い袋は(8)に示す方法で廃棄する。 (4) Dispose of the old bag used to store the reagent by the method described in (8).
(5) 作業する実験台には十分な大きさのポリエチレンコートされた濾紙などをひく。 (5) Place polyethylene-coated filter paper of sufficient size on the laboratory table to be used.
(6) 濾紙以外も場所にこぼしたら教員に報告し、直ちに適正かつ十分な中和処理を行うこと。 (6) If the substance is spilled outside the area of the filter paper, report to the instructor and immediately neutralize it properly and adequately.
(7) 使用した全ての器具(試験管などの容器、チップ、薬さじ、薬包紙)について必ず中和処理を行うこと。 (7) Be sure to perform neutralization for all the instruments used (containers such as test tubes, chips, medical spoons and powder paper).
(8) 使用した手袋、実験台に敷いた濾紙、試薬を入れていた袋などは、人が(関係者だけでなく廃棄業者も含めて)触れることがないようにして廃棄する。例えば手袋をしたまま廃棄したい袋をつかみ、それを包み込むように裏返しに手袋を脱ぎ、口を縛る。さらにこれを別の袋に入れ、口を縛って廃棄する。この際、中にチップなどの先のとがった袋を破る可能性のある物を入れてはならない。チップ類は別途中和処理を行って廃棄すること。 (8) Dispose of the used glove, filter paper on the laboratory table and reagent bag, keeping them away from people (not only those in the laboratoy but also those involved in waste disposal). For example, hold the bag to be disposed of while wearing gloves, then take the gloves off inside out such that they envelop the bag and then bind them at the top. Moreover, put the entirety into another bag, bind the top of the bag and dispose. Be sure not to include any sharp objects, such as a tip, which may tear the bag. Dispose of the tips after separate neutralization.
   

2.8.5. 発癌性物質の処理

2.8.5 Treatment of carcinogens

以下に述べる方法は一般的なものであり完全ではない。状況に応じた処理方法を各自で調べ工夫すること。 The following are general precautions and not to be considered complete. Study and devise proper suitable treatments by yourself.
(1) エチジウムブロマイド (1) Ethidium bromide
次亜塩素酸ナトリウム溶液で処理することが多いが、完全に発ガン性を中和できるわけではなく、かえって毒性が強くなるとも言われている。また、Molecular Cloning第2版E8に記載されている過マンガン酸カリウムなどによる酸化処理も完全ではない。そこで、ゲル染色液などの希薄な溶液、平衡密度勾配遠心に用いた濃厚な溶液は、共に含ハロゲン廃液として専門業者に処理を委託する。なお、希薄な廃液の場合、活性炭あるいはAmberlite XAD-16に吸着させて処理する(Molecular Cloning第2版E9参照)。ただし、使用した活性炭、Amberlite XAD-16を適切に処分すること。 This is often treated with sodium hypochlorite solution, however, its carcinogenicity cannot be completely neutralized, and it is also said that its toxicity may in fact be increased. The oxidation treatment with potassium permanganate described in “Molecular Cloning (2nd Ed., E8)” is also incomplete. Therefore, hire a professional disposer to dispose of dilute solution, such as gel stain solution, and concentrated solution used for equilibrium density-gradient centrifugation, treating them both as halogen-containing waste liquid. The dilute waste should be treated by adsorption into activated carbon or Amberlite XAD-16 (refer to “Molecular Cloning (2nd Ed., E9)”). Here, the activated carbon or Amberlite XAD-16 used must be properly disposed of.
なお、エチジウムブロマイドで汚染した箇所は、暗所で紫外線ランプをあてるとオレンジ色に光る。短波長の紫外線を用いた方が検出感度が高いが、短波長の紫外線自体にも発ガン性があるので注意すること。万一皮膚に付着した場合(付着した可能性がある場合)、長波長の紫外線ランプで確認し、オレンジ色に光らなくなるまでブラシと石鹸を用いて洗浄する。 A spot contaminated with ethidium bromide shows orange luminescence when ultraviolet light is irradiated in the dark. Although the detection sensitivity is higher when using short-wavelength ultraviolet light, such light is itself carcinogenic. If ethidium bromide comes into contact with the skin (or there is a possibility of it having come into contact with the skin), check for orange luminescence using the long-wavelength ultraviolet lamp and wash the skin with a brush and soap until the orange luminescence is no longer seen.
(2) ニトロソグアニジン (2) Nitrosoguanidine
酸性もしくはアルカリ性溶液としてオートクレーブで加熱すれば分解する。加熱処理できない所に絶対にこぼさないように細心の注意を払わなければならない。 Nitrosoguanidine is decomposed upon heating in an autoclave as an acid or alkali solution. Take special caution never to spill this solution in a space where heat treatment is prohibited.
(3) エチルメタンスルホン酸(EMS) (3) Ethylmethane sulfonate (EMS)
次亜塩素酸ナトリウム溶液もしくはチオ硫酸ナトリウム溶液で中和する。「微生物遺伝学実験法」によれば、3%のEMS 0.2 mLを中和するのに6%次亜塩素酸ナトリウム溶液9.8 mLを使用している。また、万一こぼした場合は手袋をして次亜塩素酸ナトリウム溶液で十分に拭くこと。 Neutralize this solution with sodium hypochlorite or sodium thiosulfate solution. According to “Microorganism Genetics Experiment Method,” 9.8 mL of 6% sodium hypochlorite solution is used to neutralize 0.2 mL of 3% EMS. If EMS is spilled, wipe it thoroughly with sodium hypochlorite solution wearing gloves.
   

2.8.6. 核酸のフェノール/クロロホルム抽出

2.8.6 Extraction of nucleic acid with phenol/chloroform

(1) 保護眼鏡をかけ、手袋をして扱う (1) Wear protective glasses and gloves when treating phenol/chloroform
フェノール/クロロホルム抽出を行う場合、密閉性に問題ないメーカーのチューブを用いること。チューブのメーカーによっては密閉性が悪く試料が漏れるチューブが一部混ざっている場合があり、ボルテックスする際には特に注意が必要である。必ず保護眼鏡をかけ、手袋をして扱うこと。 When extracting nucleic acid with phenol/chloroform, use a tube made by a manufacturer with a reliable sealing level. Depending on the manufacturer, some tubes that are insufficiently sealed and cause sample leakage may be included in the provided supply, which will require special attention when mixing tubes using a vortex mixer. Be sure to wear protective glasses and gloves.
(2) フェノールもしくはクロロホルムが目に入ったり皮膚に付着した場合 (2) When phenol or chloroform comes into contact with the eye or the skin
万一目に入った場合、直ちに(数秒以内に)多量の水で15分以上洗浄した後、医師による処置を受けること。皮膚に付着した場合、絶対にエタノールなどの溶媒で拭いてはならない。溶媒で皮脂が除去され、よけいにひどい火傷を負う。皮膚に付着したら直ちに水で流した後、石鹸で洗う。 If it enters the eye, immediately (within a few seconds) flush the eye with water for more than 15 minutes, and then, see a doctor. If it comes in contact with the skin, never wipe it with ethanol. Skin oil will be removed by the solvent, which will cause an even worse burn. Immediately wash it away with water, and then with soap.
(3) 廃液は回収する (3) Collect the waste liquid
廃液は必ず回収し、然るべき廃棄業者に処理を委託すること。チューブに入れたまま捨ててはならない。不燃物として処理されるチューブは、多くの場合埋め立て処理されるので、環境を汚染し、作業員を危険にさらす。 Be sure to collect waste liquid and hire the proper waste disposal firm for its disposal. Do not dispose of it in the tube. Tubes are disposed of as nonflammable substances, which are usually used as landfill. Therefore, tubes with waste liquid will contaminate the environment and pose a danger to the worker.
   

2.8.7. 注意すべき英語の表示

 

癌になる可能性がある May cause cancer
変異剤(発癌剤) Mutagen
強燃性 Flammable
可燃性 Combustible
有毒、有害 Harmful
吸入すると有害である Harmful by inhalation
腐食性 Corrosive
催涙性 Lachrymator
刺激物 Irritant
刺激がある Cause irritation
蒸気を吸ってはならない Do not breathe fumes (vapor)
粉末を吸い込むのを避けよ Avoid breathing dust
デシケーターに保存せよ(湿気を避けよ) Store desiccated
 〜℃以下で保存せよ Store below 〜 C
室温で保存せよ(冷蔵、冷凍してはならない) Store at room temperature
窒素置換して保存せよ Store under nitrogen
空気を嫌う(酸素、湿気で分解する) Air sensitive
遮光せよ Protect from light
   

2.9. 液体ガス、ガスボンベの取扱い

2.9 Handling of Liquid Gas and Gas Cylinder

水素などの可燃性ガス、酸素ガスなどは爆発火災に関する注意が必要なのは容易に理解できるが、窒素、アルゴン、炭酸ガスなども窒息死亡事故につながる場合があり、注意が必要である。 It is easily understood that combustible gases, such as hydrogen and oxygen, must be treated with caution to avoid explosion and fire. Nitrogen, argon and carbon dioxide, which may cause fatal suffocation, must also be treated with care.
   
2.9.1. 運搬にエレベーターを使う場合 2.9.1 If using the elevator for delivery
運搬にエレベーターを使う場合、液体ガス容器やボンベと同乗してはならない。希にボンベのバルブが壊れてガスが噴出することがあり、同乗していれば高い確率で窒息死する。また、液体ガスの場合、万一エレベーター内でこぼした場合、気化したガスで窒息することがある。停電などでエレベーターが止まった場合、こぼさなくても気化したガスで窒息する場合がある。液体ガスの容器やボンベをエレベーターに載せたら、目的階のボタンを押して無人運転し、人は階段を利用しなければならない。なお、エレベーターのドアが開いたとき、ボンベや容器が載っていればそのエレベーターには乗ってはならない。 Do not ride the elevator with a liquid gas container or cylinder during delivery. The valve of the cylinder may sometimes break and cause gas blowout, leading to a high probability of death by suffocation to any person in the elevator. If liquid gas is spilled in an elevator, vaporized gas may cause suffocation. If the elevator stops because of a power outage, vaporized gas may cause suffocation even if liquid gas is not spilled. When a liquid gas container or cylinder is transported by elevator, press the button for the desired floor and leave the elevator unmanned; persons must take the stairs. When the door of an elevator opens, do not get on if there is a liquid gas container or cylinder.
   
2.9.2. 液化ガスを扱う場合 2.9.2 When handling liquid gas
低温センターの講習会を受講した上、講習会で配布されるマニュアルを熟読した者以外が単独で液化ガスを取り扱うことを禁ずる。 Only persons who have attended the lecture at the Low Temperature Center and have carefully read the manual concerning handling, which is distributed at the lecture, are permitted to treat liquefied gas unassisted.
液体窒素などの液体ガスを扱う場合、冬期であっても窓を開けること。換気できない部屋での使用を禁ずる。複数の大学や企業で、換気のない部屋で液体窒素を使用して窒息死する事故が実際に起きている。酸素欠乏状態になると、意識が朦朧となり、気づいたときには脱出したり助けを呼んだりすることはほとんど不可能な状態になる。 When treating liquid gas, such as liquid nitrogen, open the window even in winter. Never use it in a room that cannot be ventilated. In several universities and companies, there have been fatal suffocation accidents caused by the use of liquid nitrogen in unventilated rooms. With a lack of oxygen, a person will become groggy and probably be unable to escape or call for help.
   

2.9.3. ガスボンベを扱う場合

2.9.3 When handling a gas cylinder

高圧ガスに関する安全取り扱い講習会を受講した者以外が単独でガスボンベを取り扱うことを禁ずる。 Only persons who have attended the lecture concerning safe handling of high-pressure gas are permitted to handle the gas cylinders unassisted.
(1) 必ず転倒防止措置を講ずる (1) Be sure to take precautions to prevent falling
転倒したボンベの下敷きになって負傷する直接的な危険の他に、バルブが破損してガスが噴出すれば、ボンベはロケットのように飛び、爆発火災事故や窒息死事故にもつながる。専用のボンベ台を設置し、チエーン等で確実に固定すること。 There is a direct risk of injury being caused by being trapped under a fallen cylinder. In addition, if the valve breaks and the gas blows out, the cylinder may fly like a rocket, causing an explosion and fire or fatal suffocation. Install a special cylinder rack and fix it securely with a chain or other measures.
(2) 漏れのチエックを行う (2) Check for leakage
レギュレーターを取り付けたら必ず石鹸水を塗るなどして漏れのチエックを行うこと。可燃性ガス、有毒ガスは洩れると危険であることは言うまでもないが、酸素も多量に洩れると、普段は発火しないものも発火して危険である(綿などは自然発火し、金属は軽く触れあうだけでも大きな火花が散る)。 After attaching the regulator, be sure to check for leakage by applying soapy water to it. Leakage of combustible gas or toxic gas is dangerous, as is the leakage of a large amount of oxygen because it may ignite (cotton will spontaneously combust, and heavy sparks may be generated when metal parts come in contact with each other even lightly).
(3) ボンベの元栓を開ける作業は危険な作業である。 (3) Opening the main valve of the cylinder is a dangerous operation
ボンベの元栓を開ける際には、レギュレーターを取り付けてある方向に立ってはならない。万一レギュレーターの取り付けが不完全であった場合、レギュレーターが高速で飛んでくる。元栓を開ける際には、レギュレーターの取り付けてある方向は無人であり、かつ、破損したら危険を生じる器具がない状態でなければならない。 When opening the main valve of the cylinder, do not stand on the side at which the regulator is attached. If the regulator is not completely attached, it may fly off at high speed. When opening the main valve, leave the side of the regulator unattended and keep instruments, which may create a hazard when broken, away from that side.
   

3.正しく実験を行うために

3. Carrying Out Proper Experiments

3.1. 試薬、試料の保存

3.1 Storage of Reagent and Sample

3.1.1. 希釈した溶液は不安定である。

3.1.1 Diluted solution is unstable.

一般に希釈した試薬、試料は不安定である。保存は濃厚な状態で行うべきである。 Diluted reagents and samples are generally unstable. They should be stored at high concentration.
(1) 酵素的分解 (1) Enzymatic Degradation
微量でもヌクレアーゼ、プロテアーゼが混在すれば(雑菌の混入はヌクレアーゼ、プロテアーゼの混入を意味する)その試料は分解する。この時、試料が高濃度であれば大部分は分解を免れる。 A sample degrades when mixed with even a small amount of nuclease or protease (contamination means incorporation of nuclease or protease). Therefore, a sample at high concentration is mostly free from degradation.
(2) 容器への吸着 (2) Container Adsorption
プラスチック、ガラスは1 cm2当たり0.1〜1g程度の核酸や蛋白質を吸着する。容器への吸着によるロスは、核酸溶液の場合は容器をシリコナイズすることによって(Molecular Cloning E1〜E2参照)、蛋白質溶液の場合は0.1%程度の牛血清アルブミン(BSA)を添加することによってかなり防ぐことができる。 Plastic or glass adsorbs approximately 0.1 – 1g of nucleic acid or protein per 1 cm2. The loss caused by container adsorption can be considerably prevented by siliconizing the container in the case of nucleic acid solution (refer to “Molecular Cloning E1 – E2”) and by adding approximately 0.1% of bovine serum albumin (BSA) in the case of protein solution.
(3) 酸化 (3) Oxidation
30℃の純水は最大7.4 mg/L (=0.23 mM)の酸素分子を含み、低温では更に高濃度の酸素分子が溶解する。例えば1価のチオール4分子は酸素分子1分子で酸化されるので、1 mM以下の溶液は密閉保存しても溶存酸素によって酸化されてしまう。 Pure water at 30oC contains 7.4 mg/L (= 0.23 mM) of oxygen molecules at maximum, and oxygen at higher concentration is soluble at lower temperatures. For example, 4 monovalent thiol molecules are oxidized by one oxygen molecule and therefore, a solution of 1 mM or less is oxidized by dissolved oxygen even if kept in a closed container.
   

3.1.2. 「生もの」の冷蔵、冷凍保存時の注意

3.1.2 Precautions when refrigerating or freezing “perishables”

あなたは何日も冷蔵保存した刺身を食べますか? 刺身は例え1日でも保存すれば風味が変化し、風味の変化は成分の変化を意味する。細胞には必ずヌクレアーゼ、プロテアーゼが含まれており、細胞から抽出した蛋白質や核酸などの試料は、高度に精製しない限り、これらによる分解を受ける。できるだけ低温で扱い、手早く実験を終えるような工夫が必要である。冷凍した場合も安定であるとは限らない。冷凍保存時の劣化は程度の問題であるから(全く劣化しない保存方法はあり得ない)、必要以上に神経質になる必要はないが、以下の点に留意する必要がある。 Do you eat sushi that has been refrigerated for several days? Sushi (raw fish) loses flavor when refrigerated even for one day, which means that its components have changed. A cell always contains nuclease and protease. Samples extracted from a cell, such as protein and nucleic acid, are degraded by nuclease or protease unless highly purified. Therefore, an experiment using such samples must be carried out at as low a temperature as possible and completed quickly. Even a frozen sample is not necessarily stable. Because deterioration by freezing is a matter of degree (there is no storage method that completely prevents deterioration), one need not be excessively cautious but should take care with the following.
(1) 細胞を凍結させると、細胞内の水の氷結による物理的な力によって大きなターメージを受ける(水は凍ると体積が増加し、細胞にダメージを与える大きな氷の結晶は-20℃前後で特に成長が早い)。また、大きな蛋白質分子も凍結すると失活する場合がある。グリセリンなどの適当な保護剤を添加する必要がある。 (1) When frozen, a cell is heavily damaged by the physical force generated by the freezing of water within the cell (when water is frozen, its volume increases; large ice crystals that damage the cell grow easily, particularly at approximately –20oC). Large protein molecules may also be deactivated when frozen. An appropriate protective agent, such as glycerol, must be added.
(2) 冷凍温度が-20℃程度である場合、不凍水部分でプロテアーゼ、ヌクレアーゼが有意に働く(細胞由来の粗精製試料には必ずプロテアーゼ、ヌクレアーゼが含まれている)。 (2) If the freezing temperature is approximately -20oC, protease and nuclease are active significantly in a nonfrozen solution (a roughly purified sample extracted from cells always contains protease and nuclease).
(3) 試料に含まれる塩の溶解度の関係で、凍結させると大きくpHが変化する場合がある。例えばpH 7のリン酸ナトリウム緩衝液はNaH2PO4とNa2HPO4を混合して作るが、冷却すると、まず水が氷り、不凍水部分のリン酸ナトリウムの濃度が上がる。Na2HPO4の溶解度はNaH2PO4のそれよりも低いため、まず、Na2HPO4が析出する。残ったNaH2PO4のpHは低く、不凍水部分のpHは4程度まで下がり、蛋白質が失活する場合がある(この場合、蛋白質濃度が高ければ、蛋白質自体に緩衝能があるのでこのような極端なpHの変化を避けることができる。また、10%(w/v)程度のグリセリンを添加するとpHの変化はかなり軽減できる)。 (3) When the sample is frozen, its pH may change markedly, depending on the solubility of the salt contained in the sample. For example, a sodium phosphate buffer of pH 7 is made by mixing NaH2PO4 with Na2HPO4, and when cooled, water first turns to ice and the concentration of sodium phosphate within the nonfrozen solution increases. Because the solubility of Na2HPO4 is lower than that of NaH2PO4, Na2HPO4 is precipitated first. Because the pH of the remaining NaH2PO4 is low, that of the nonfrozen solution decreases to 4 and in some cases protein may be deactivated. (Protein at high concentration is free from such an extreme pH change because of its own buffering capacity. The pH change can be considerably reduced also by adding approximately 10% (w/v) glycerol.)
(4) 不安定な試料は、一般に、-20℃で凍結保存するよりも-80℃で凍結保存する方が無難である(ただし凍結によって失活するものもあるので注意すること)。 (4) It is generally better to freeze an unstable sample at -80oC than at -20oC (care should be taken as some samples may be deactivated by freezing).
   

3.1.3. 保存方法

3.1.3 Storage Method

(1) 蛋白質 (1) Protein
個々の蛋白質によって安定な保存方法は異なるが、一般に2〜3 Mの硫酸アンモニウム懸濁液、50%グリセロール溶液として低温(蛋白質によって適当な温度は異なる)で保存するのが安定である。また、適当なプロテアーゼ阻害剤を添加しておくことが望ましい。 Each protein has an optimal storage method to keep the protein stable. In general, proteins are stable when stored as a 2 - 3 M ammonium sulfate suspension or 50% glycerol solution at a low temperature (each protein has its own optimal temperature for storage). It is desirable to add an appropriate protease inhibitors.
(2) 核酸 (2) Nucleic Acid
乾燥状態、もしくは、TE溶液に等量のエタノールを添加して-20℃で凍らせずに保存するのが最も安定であるとされている。 Nucleic acid is considered to remain most stable when stored in a dried state or in TE solution with an equivalent amount of ethanol added, kept in a liquid state at –20oC.
   

3.2. 天秤

3.2 Balance

電子天秤は5桁、6桁表示するものもあるが、気圧、湿度によって浮力は異なり、上皿天秤以外は緯度や高度(重力)によって重量は異なる。また、試薬は多かれ少なかれ吸湿する。従って、適正なキャリブレーションを行い、吸湿に十分配慮しない限り、4桁目以降は信用できないと考えるべきである。乾燥重量を測定する場合などを除いて、秤量した試薬のほとんどは溶液として使用するのであるから、メスシリンダー、メスフラスコの誤差(それぞれ0.5%、0.1%程度)も考慮すること。 Although some electronic balances can display a value to a 5- or 6-digit accuracy, buoyancy varies depending on pressure or humidity and weight varies depending on latitude or altitude (gravity) except when measured with a scale balance. In addition, a reagent absorbs moisture to some degree. Therefore, the balance should be properly calibrated and it is considered that a value beyond four significant digits is not reliable unless humidity is well taken into account. Because most scaled reagents are used as solutions, except when a dry weight is measured, errors of the measuring cylinder and measuring flask (approximately 0.5% and 0.1%, respectively) should be considered.
   

3.2.1. 使用上の注意

3.2.1 Careful use

(1) 水平を確認する。 (1) Check levelness
精密天秤には水準器が付いており、これを用いて水平をとること(θ度傾いていればsinθ低い値が表示される)。 A precision balance is equipped with a level. Make the balance horizontal using the level (if there is an inclination of  degrees, a value sin lower is displayed).
(2) キャリブレーションを行う (2) Calibrate balance
上にも述べたように、気圧によって浮力は異なるので、正確に秤量したいのならキャリブレーションをしてから使用すること。キャリブレーションの方法は天秤によって異なるのでそれぞれの取扱説明書を参照すること。 Because the buoyancy varies depending on the pressure, as mentioned above, use the balance after calibration if accuracy is required. Because each balance has its proper calibration method, refer to the respective instruction manual.
   

3.2.2. 試薬をこぼしたら

3.2.2 If reagent is spilled

こぼしたらその場で拭き取る。放置すれば以下のような問題をひき起こす。 Wipe a spilled reagent immediately, otherwise, the following problems will arise.
(1) こぼした試薬が天秤を腐食させたり、腐敗して微生物的汚染を引き起こす(微生物的汚染=ヌクレアーゼ+プロテアーゼ)。 (1) A spilled reagent will corrode and corrupt the balance, causing microbial contamination (microbial contamination = nuclease + protease).
(2) こぼした試薬の処理方法は試薬によって異なる。処理法法が不明なら教員の指導を仰ぐこと。 (2) Each reagent has a specific method of treatment when spilled. If the method is unknown, follow the instructions of the instructor.
(3) こぼした試薬は、次の試薬を秤量する薬包紙の裏に付着し、次の試薬に混入する。 (3) A spilled reagent will adhere to the back of the powder paper to be used in the next measurement and will contaminate the next reagent.
こぼした試薬の素性を知っているのは、こぼしたあなただけです。あなたがその場で適切な処理をする義務があります。放置すれば関係者に危害を及ぼしたり実験を失敗させることを肝に銘じなくてはなりません。 Only the person who spilled the reagent knows its true identity. If you spill a reagent, you are obliged to treat it appropriately immediately. Keep in mind that the spilled reagent may cause harm to other persons involved or may ruin their experiments.
   

3.3. メスピペット

3.3 Measuring Pipette

3.3.1. 安全ピペッター

3.3.1 Safety Pipetter

安全だと判っている溶液以外は安全ピペッターを使用する。なお、安全ピペッターにメスピペットを挿入する際には、2.2.2. に述べた注意が必要である。また、安全ピペッターに誤って溶液を吸い込んでしまった場合、直ちに以下の要領で洗浄すること。放置すれば次に使う者に危害を与える(排気する際に吸い込んだ溶液が飛び散る)。 When measuring a solution other than that recognized to be safe, use a safety pipetter. When inserting a measuring pipette into the safety pipetter, exercise caution, as instructed in 2.2.2. If a solution is accidentally drawn up into the safety pipetter, rinse it immediately as described below. Otherwise, it may cause harm to the next user (the solution drawn up may spatter when exhausted).
誤って吸い込んだ場合、蒸留水を吸い込んで捨てる操作を10回以上繰り返す。その後、弁の部分を大型クリップなどでつまんで開放した状態でコンプレッサー等を用いて通気し、乾燥させる。 If the solution is accidentally drawn up, draw up and drain the distilled water. Repeat this operation ten times or more. Then, pinch the pipetter valve with a binder clip, and ventilate and dry the safety pipetter using a compressor, while keeping the valve open.
   

3.3.2. 誤差

3.3.2 Error

(1) 誤差の要因 (1) Error factor
メスピペット、ホールピペットの標示量は、標線まで吸上げた20℃の水を自然落下させた時の流出量である。従って、以下の場合は正しく採量できない。なお、ディスポーザブルピペットは検定が行われていないものもあり、中には1割近い誤差があるものもある。 The labeled amount of a measuring pipette or whole pipette indicates the amount of flow for free-falling water at 20oC after being drawn up to the gauge line. Therefore, an accurate volume of the solution cannot be measured with these pipettes in the following cases. Moreover, some disposable pipettes have not been tested and some have an error as high as nearly 10%.
1) 口で吹出した時 → 少なくなる 1) When the solution is blown out with the mouth → measured volume tends to be small
2) 洗浄が不十分でピペット内壁に水滴が残留する時 → 少なくなる 2) When moisture is left on the inner wall of the pipette because of insufficient rinsing → smaller volume
3) 外壁に溶液が付着している時 → 多くなる 3) When the solution is attached to the outer wall of the pipette → greater volume
4) 高温の溶液 → 多くなる 4) When the solution is a high-temperature solution → greater volume
5) 高粘度溶液 → 少なくなる 5) When the solution is a highly viscous solution → smaller volume
(2) 高粘度溶液の取り扱い (2) Handling of highly viscous solution
高粘度の溶液(例えば、高濃度の糖、グリセリン、蛋白、界面活性剤などの溶液)は内壁に残る量が多く、正確に採量できない。1) 重量で測定する(Merk Indexなどで比重を調べて計算する)、2) 注射器を用いるなどの個別の手段を講じるべきである。 A highly viscous solution (e.g., sugar at high concentration, glycerin, protein, and surfactant solution) cannot be measured accurately because an appreciable amount of solution is left on the inner wall of the pipette. The following measures should be taken: 1) measure the weight (examine the specific gravity in indices, such as “Merck Index” and then, calculate the volume), 2) use an injector.
   

3.4. ピペットマン

3.4 Pipetman

3.4.1. 基本操作

3.4.1 Basic operation

(1) チップを確実に取り付け、チップの先を必要最小限溶液につける。 (1) Be sure to attach a chip. Dip only the smallest necessary portion of the tip of the chip into the solution.
(2) ピペットマンを垂直に持ち、ゆっくり溶液を吸上げる。 (2) Hold the Pipetman vertically and draw up the solution slowly.
(3) ゆっくり溶液を押出す。チップの内壁の溶液がチップの先まで下りるのを待ってから最後まで押込む。 (3) Drain the solution slowly. Wait until the solution on the inner wall of the chip descends to the tip of the chip, then push the piston into the pipette completely.
(4) チップの内側に溶液が残っていないことを確認する。 (4) Check that no solution remains inside the chip.
   

3.4.2. 注意点

3.4.2 Precautions

(1) 揮発性の強酸溶液を吸ってはならない (1) Do not draw up a volatile strong acid solution.
塩酸、トリフルオロ酢酸などは蒸気がピペットマン内部のステンレス製のピストンを腐食させる。これらを使用した場合、使用不能になる場合があるので直ちに3.4.4の要領で分解洗浄する。 Vapor from hydrochloric acid or trifluoroacetic acid corrodes the stainless-steel piston in the Pipetman. If these acids are used, the Pipetman will become unusable. In such a case, disassemble the Pipetman and wash it immediately, as instructed in 3.4.4.
(2) チップの先に残った溶液に注意する (2) Beware of a small amount of solution remaining on the tip of the chip.
溶液を吸引する場合にはピストンを一度押込むが、この時にチップの先から空気が押し出される。一度使用したチップの先には溶液が残っている場合が多く、これに気付かずにピストンを押し込めば、チップの先に残った溶液は細かな飛沫となって飛び散る。危険な溶液(発癌物質、劇毒物、微生物、強酸、強アルカリなど)を扱う場合、特に注意が必要である。これを避けるためには、以下のような十分な配慮が必要である Before drawing up the solution, the piston must first be pushed into the pipette. At this time, air is forced out of the tip of the chip. A small amount of solution often remains in the tip of a previously used chip. Such a solution will be ejected as fine droplets by pushing the piston. When using dangerous solutions (carcinogens, poisonous and deleterious substances, microorganisms, strong acid, strong alkali, etc.), exercise particular caution. To avoid accidents, take sufficient precautions as follows.
1) チップの先に溶液を残さないように十分時間をかけてゆっくり排出する。 1) Take time to slowly drain the solution from the tip of the chip completely.
2) チップを再使用しないようにする。 2) Do not reuse a chip.
3) ピストンを押し込む際にチップの先を容器の中に入れておく。 3) Place the tip of the chip in a container when pushing the piston fully.
(3) ゆっくり操作する (3) Operate the Pipetman slowly.
急に吸い込めば、本体にまで溶液を吸い込んでしまうし(直ちに3.4.4.の要領で分解洗浄する)、正確な量を吸引できない。また、急に押し出せばチップの内壁に溶液が残留し、やはり正しく計量できない。 If the solution is drawn up suddenly, it may penetrate the body of the Pipetman (in such a case, disassemble it and wash it immediately as instructed in 3.4.4.), and accurate measurement of the volume will not be possible. When the solution is drained suddenly, a small amount of solution remains on the inner wall of the chip, again causing inaccurate measurement.
(4) 目盛の限界を越えて設定してはならない (4) Do not set the scale beyond the limit.
例えば、P-20で25 Lに設定したりしてはならない。狂う。故障の原因になる。 For example, do not set the scale at 25 L for P-20, as it may cause inaccuracy or breakdown.
   

3.4.3. 誤差

3.4.3 Error

十分なメインテナンスを行い、新しいチップを用いて正しい手順で操作すれば再現性はあるが、絶対量に関しては2〜3%狂っていることも希ではない。絶対誤差が問題になる実験に使用する場合、純水(比重は1)を天秤で秤量してキャリブレーションしてから使用すべきである。また、以下の溶液は正確に計量できないと考えるべきである。 When maintained sufficiently well, used with a new chip and operated properly, the Pipetman has good repro-ducibility. However, the measured amount may have an error of 2–3% compared with the absolute amount. When using the Pipetman in an experiment in which this absolute error becomes a problem, calibrate it by measuring the volume of pure water (relative density = 1.00) using a balance. It is considered that the following solutions cannot be measured accurately.
1) 高粘度溶液(高濃度のグリセリン、糖、界面活性剤、高濃度タンパク質溶液など) 1) Highly viscous solution (glycerin at high concentration, sugar, surfactant solution, protein solution at high concentration, etc.)
2) 高温の溶液(室温まで冷却してから計量すべきである) 2) High-temperature solution (this should be measured after cooling to room temperature)
3) 揮発性溶媒(クロロホルム、アセトンなど) 3) Volatile solution (chloroform, acetone, etc.)
   

3.4.4. メインテナンス

3.4.4 Maintenance

試料溶液を本体に吸い込んでしまった場合、及び腐食性の酸を扱った場合は分解洗浄をしなくてはならない。怠ればステンレス製のピストンが腐食し、簡単に修理できなくなる。培地成分や培養液を吸込んだ場合は内部で雑菌が繁殖し、微生物やヌクレアーゼのコンタミのもとになる。分解洗浄の手順は以下の通り、 If a test solution is drawn into the body of the Pipetman or corrosive acid is used, disassemble and wash the Pipetman. Otherwise, the stainless-steel piston will be corroded, which cannot be easily repaired. If a medium component or culture solution is drawn into the body, bacteria may propagate inside the Pipetman, causing microorganism or nuclease contamination. The disassembly and washing procedure is as follows.
1) リムーバーを外す。 1) Detach the remover.
2) ノーズを取り外し、洗浄する(最後は純水でリンスする)。 2) Remove the nose and wash it (rinse finally with pure water).
3) ピストンにはめ込まれたO-リングとテフロン製のシールを取り外す。 3) Remove the O-ring and Teflon-coated seal attached on the piston.
4) 純水かエタノールなどをしみ込ませたキムワイプなどでピストン部分を十分に拭く。
汚れがひどい場合、柔らかいスポンジに洗剤をつけてこする。また、サビは0.1〜1 M程度のdithiothreitol(古いものでも良い)溶液で拭くとよく落ちる。
4) Wipe the piston well using Kimwipe soaked with pure water or ethanol. If heavily contaminated, scrub it using a soft sponge with detergent. Rust can be wiped off using 0.1 – 1 M dithiothreitol solution (old solution is sufficient).
5) ピストン、ノーズを十分に乾燥させた後、元通り組み立てる。 5) After drying the piston and nose completely, reassemble them.
6) 天秤で水を秤量し、再現性と溶液の漏れ(チップから溶液がしたたり落ちないか)を確認する。もし再現性にとぼしかったり、漏れがあれば、再度分解し、O-リングとテフロン製のシールを新しいものに交換する。O-リングとテフロン製のシールは常備しておくことが望ましい。 6) Measure the volume of water using a balance and check the reproducibility of the Pipetman and for any solution leakage (whether or not solution drips from the chip). If reproducibility is poor or solution leakage is detected, disassemble the Pipetman again and replace the O-ring and Teflon-coated seal with new ones. Always have a supply of O-rings and Teflon-coated seals in stock.
   

3.4.5. ピペットマンによる容量の測定

3.4.5 Volume measurement using Pipetman

ピペットマンの目盛りを予想される容量よりやや少ない目に合わせて計量したい溶液を吸う(A)。チップを溶液につけたままツマミを回すことによって溶液を全部吸い取る(B)。一度溶液を戻し(C)、再度吸い取った時、丁度溶液を全部吸い取った状態になるかを確認し、必要なら目盛りを再調整する。その時の目盛りがその溶液の容量(D)。ただし、キャリブレーションしたピペットマンを正しく使うこと。 Set the scale of the Pipetman at a value slightly less than that needed and draw up the solution to be measured (A). Draw it up completely by turning the knob while the chip is held in the solution (B). Drain the solution from the tip once (C). Then, draw it up again and check that the solution has been drawn up completely. Adjust the scale again if necessary. The scale measured as above can indicate the volume of the solution (D). Use a calibrated Pipetman properly.
   

3.5. スターラー

3.5 Stirrer

3.5.1. マグネットバーの入れ方

3.5.1 Putting in the magnet bar

マグネットバーをガラス容器に入れる場合、容器を斜めにして滑らせるように入れること。既に溶液が入っていて斜めにできない場合などは、マグネットバーを容器側面に当てた磁石にくっつけ、ゆっくり容器の底に導くようにする。スターラーの上に乗せた状態で上からマグネットバーを落としたりしてはならない(2.2.1.-(7)参照)。 When putting the magnet bar into a glass container, slide the magnet bar into the tilted container. When the container cannot be tilted because it already contains a solution, attach the magnet bar to a magnet placed on the outside of the container and slowly lead the magnet bar to the bottom of the container. Do not drop the magnet bar into the container on the stirrer (refer to 2.2.1.–(7)).
なお、マグネットバーには金属(磁石)が入っているので、マグネットバーを入れたまま電子レンジで加熱してはならない。 Because the magnet bar is made of metal, do not heat a container with a magnet bar in a microwave.
   

3.5.2. 加熱装置付きスターラー(ホットプレートスターラー)

3.5.2 Stirrer with heating device (hot-plate stirrer)

加熱中にその場を離れてはならない。忘れて試料が焦げ付いたり、他の者が触れて火傷をする場合がある。また、ガラス容器のみを使用し、プラスチック容器を用いてはならない。 Do not leave the hot-plate stirrer unattended during heating. The sample may burn dry or other people may touch the apparatus inadvertently and be burned. Use only a glass container, never a plastic one.
   

3.6. ボルテックスミキサー

3.6 Vortex Mixer

3.6.1. 使用時の注意

3.6.1 Precautions

(1) 溶液は手で支えた位置まで上がってくる (1) Solution may ascend to the position of the supporting hand.
ボルテックスミキサーは回転運動をするので、ある程度の液量があれば支点(手で持った位置)まで液が上がってくる。逆に言えば、試験管の口を持てば溶液はこぼれる。 Because the vortex mixer rotates, a small amount of solution may ascend to the supporting point (position of the supporting hand) if a certain amount of solution is placed in the mixer. Conversely, the solution may spill if the orifice of the test tube is held.
(2) 1/3以上溶液が入った試験管を混合するべきではない (2) Do not set a test tube that is more than one-third full.
特にその溶液が危険な試薬を含んでいる場合、こぼして事故のもとになる。このような場合は、1/3以下の容量で混合できるように実験系を考え直すか、パラフィルムで口を覆って、逆さにして混ぜるなどの工夫をするべきである。 In particular, if the solution contains dangerous reagents, a spilled solution will cause an accident. To avoid such an accident, modify the experimental system so that a solution of one-third or less the volume of the test tube is mixed, or mix the solution/shake the test tube upside down with the mouth of the test tube covered with Parafilm.
   

3.6.2. 完全に混合するには

3.6.2 To mix solution completely

(1) 2〜3回まわしただけでは完全混合はできない (1) The solution cannot be completely mixed merely by rotating the mixer 2 - 3 times.
溶液は層流となって回るので(溶液の上層は上層で、下層は下層でまわるので)、回転−停止のサイクルを少なくとも数回以上繰り返して乱流を作らなければ完全に混合することはできない。 Because the solution circulates in the form of a laminar flow (the upper layer of the solution circulates only in the upper layer, and the lower layer circulates in the lower), it cannot be completely mixed unless the rotation – pause cycle is repeated several times to generate a turbulent flow.
(2) 溶液の量は1/3以下にするべきである (2) The amount of solution should be one-third or less than the volume of the test tube.
1/3以上溶液が入っている場合、よほど丁寧に混ぜない限り完全混合はできない。パラフィルムを巻いて数回逆さにして混ぜる方が早くて確実である。 If the amount of solution is one-third or more than the volume of the test tube, the solution cannot be completely mixed unless considerable care is taken. It is easier and more reliable to mix the solution upside down several times with the test tube wrapped in Parafilm.
   

3.7. クリーンベンチ

3.7 Clean Bench

3.7.1. 安全上の注意

3.7.1 Safety precautions

(1) ガスバーナーを消す (1) Turn off the gas burner.
作業終了時はもちろん、クリーンベンチを離れる場合、例え短時間であってもガスバーナーを消すこと。なお、ガスバーナーはクリーンベンチの壁面から十分に離して置くこと。壁面が熱くなるような位置に置いてはならない。 When leaving the clean bench, even for a short time, as well as after completing the experiment, turn off the gas burner. Keep the gas burner a sufficient distance from the wall of the clean bench. Do not place it where the wall may be heated.
(2) 殺菌用エタノールの使用には十分注意する (2) Take sufficient precautions when using sterilizing ethanol.
コンラージ棒にエタノールを付けて燃やし殺菌する場合があるが、溶媒と火を同時に使う危険を十分に認識し、以下のように十分に注意しなければならない。 When the sample is burned and sterilized using a conradi bar with ethanol, be fully aware that it is dangerous to use solvent and fire together, and take sufficient precautions as follows.
1) 不必要に多量のエタノールをクリーンベンチ内に持ち込まない 1) Do not bring more ethanol than necessary to the clean bench.
2) エタノールはフタ付きの金属容器に入れ、作業中はフタを手元に置いておく。万一火が入った場合、あわてずフタをして消す。 2) Keep ethanol in a metal container with a lid and keep the lid within reach during operation. In the case of fire in the container, calmly close the lid to extinguish it.
3) エタノールは、引っかけても容易に倒れない安定した容器に入れる(例えば大きなガラスシャーレに容器を接着し、底面を大きくする)。 3) Keep ethanol in a stable container that does not easily fall over when jostled (for example, place the container on a large glass petri dish to increase the surface area of the base).
4) ガスバーナーとエタノールはできるだけ離す。特に、エタノールをガスバーナーの風上に置いてはならない。 4) Keep ethanol as far as possible from the gas burner. In particular, do not place ethanol windward of the gas burner.
   

3.7.2. 無菌操作のポイント

3.7.2 Sterilizing operation points

(1) 手を洗う (1) Wash your hands
微生物が増殖するのに必要な3要素は、水と栄養分と温度であり、人間の皮膚や唾液にはこの3つ全てが備わっている。手のひらには104〜106/cm2の雑菌がいるとされている。また、爪アカは雑菌のかたまりであり、107〜108の雑菌いても不思議ではない。即ち、実験室内で最も汚い物は人間である。 Three factors required for microorganism propagation are water, nutrition and sufficient temperature. Human skin or saliva satisfies all three conditions. Approximately 104〜106 bacteria/cm2 are considered to exist on the human palm. Because nail scrapings are essentially balls of bacteria, it would not be surprising to find 107〜108 bacteria in them. That is, humans are the major source of contamination in the laboratory.
 
ある条件でN0個の菌をt分間加熱殺菌した時の残存生菌数Nは、N=N0e-ktで与えられ(kは死滅速度定数)、薬剤による殺菌の場合にも、ほぼこの式が当てはまる。式から分かるように、残存性菌数を限りなくゼロに近づけるには、ktを大きくする(より厳しい条件で長い時間殺菌する)方法の他に、N0を少なくする方法がある。 The number of surviving bacteria N when N0 bacteria are sterilized by heating for t minutes under certain conditions, is given as N = N0e-kt (k: death rate constant), and this equation can be applied to most cases of chemical sterilization. As is obvious from the equation, there are two methods of reducing the number of surviving bacteria to a value as close to 0 as possible: increase kt (sterilization for a long time under severer conditions) and decrease N0.
バクテリアの栄養細胞は70%エタノールで滅菌できる場合が多いが、カビやバクテリアの胞子は滅菌できない(この場合、kはほぼゼロ)。これに対して、石鹸で手を洗えばN0を3〜4桁下げることができる。なお、爪アカは雑菌のかたまりであり、107〜108の雑菌がいても不思議ではない。雑菌のかたまりを全て薬剤で殺菌するのは非常に難しい(消毒用エタノールや逆性石けんを過信してはならない)。外科医が手術前に行うように手指を丁寧にブラッシングするのが最も効果的な方法である。 Although most nutritive cells can be sterilized using 70% ethanol, mold spores and bacteria spores are unaffected (in this case, k is nearly 0). On the contrary, N0 can be decreased by 3 – 4 orders merely by washing one’s hands with soap. Because nail scrapings are essentially balls of bacteria, they may contain as many as 107 – 108 bacteria in them. It is very difficult to sterilize the entire bacteria ball with agents (do not overestimate the effects of disinfectant ethanol or inverted soap). The most effective method is to scrub the hands and fingers carefully as a doctor does before surgery.
コンタミさせない最も効果的で、かつ、最も簡単な方法は、作業前に手を石鹸で洗うことである。 The most effective simplest method of preventing contamination is to wash your hands with soap before performing your experiment.
 
(2) 窓を閉める。 (2) Close windows
クリーンベンチ内に風が入れば当然無菌に保つことはできない。エアコンの風がクリーンベンチに直接当たる場合も同様である。 If wind blows in, a clean bench cannot be kept sterile. The same applies for the case of a clean bench exposed to airflow from an air conditioner.
(3) 無菌に保ちたい物の上に手(たとえ手を洗っても手はクリーンベンチの中で最も汚い)をかざさないよう、配置、作業手順を良く考える。 (3) Consider the placement of apparatus and the operation procedure so as not to needlessly place your hands over (even when washed, hands are the dirtiest items at the clean bench) the apparatus that is to be kept sterile.
1) 無菌に保ちたい物を奥に、無菌ではないものは手前に配置する。 1) Place objects to be kept sterile at the back and nonsterile objects at the front.
2) 原則として右手で扱うものは右側に、左手で扱うものは左側に置く。 2) As a rule, place objects handled by the right hand on the right side and those handled by the left hand on the left.
3) ビンのフタを開けるなどの両手が必要な作業は、物を持つ前に済ませておく。 3) Complete operations requiring both hands, such as opening the lid of a bottle, before taking hold of an item.
(4) しゃべらない。 (4) Do not speak.
唾液は雑菌の巣である。手術をする医師がマスクをかける意味を考えると良い。 Saliva is a major source of bacteria. Consider why a doctor wears a mask during surgery.
(5) クリーンベンチ内を清潔に保つ (5) Keep the clean bench clean.
培地等をこぼした場合、速やかに丁寧に拭き取らなければならない。腐敗して雑菌の巣になる。 If a medium is spilled, wipe it quickly and carefully. Otherwise, it will decay and become a major source of bacteria.
(6) 不必要なものを放置してはならない。 (6) Do not leave unnecessary instruments lying around.
クリーンベンチ内に未使用のシャーレ、培地、ピペットマンやミキサーなどの器具などを放置してはならない。以下のような問題が生じる。 Do not leave unused items, such as petri dishes, medium, Pipetman and mixer lying around. Otherwise, the following problems will arise.
1) 作業スペースが狭くなる。 1) The work space will be reduced.
2) 紫外線ランプの影になる部分が増え、その部分は滅菌できない。 2) Sections in shade will be increased and will not be sterilized by ultraviolet irradiation.
3) 紫外線で器具、特にプラスチック部分が劣化しボロボロになる。 3) Instruments, particularly the plastic parts, will deteriorate and become useless because of irradiation by ultraviolet.
   

3.7.3 ピペット、ピペットマンを使用する場合

3.7.3 When using pipette or Pipetman

(1) ピペットマン (1) Pipetman
ピペットマン内部は無菌ではない。ピペットマン本体内部に溶液(特に培地や培養液)を吸い込んだ場合、直ちに洗浄しないと雑菌が繁殖し、コンタミの原因となる。ピペットマンはオートクレーブできないので、フィルター付きのチップを使用するか、オートクレーブ可能なベンチメイトを使用する。なお、ピペットマンの外側も無菌ではない。逆性せっけん(塩化ベンザルコニウム溶液)などで拭いてから使用するべきである。 The inside of a Pipetman is not sterile. If a solution (in particular, medium and culture) is drawn up into the Pipetman body, rinse it immediately. Otherwise, bacteria will propagate and cause contamination. Because the Pipetman cannot be autoclaved, use a chip with a filter or a bench mate that can be autoclaved. The outside of the Pipetman is also unsterile. Wipe it with inverted soap (benzalkonium chloride solution) before use.
(2) ピペット (2) Pipette
ピペットを口で吸うとコンタミのリスクが増す。ピペッターの内部も無菌ではない。フィルター付きのディスポーザブルピペットか、綿を詰めたメスピペットを使うか、フィルターを内蔵した電動ピペッターを用いるなどの対策が必要。 When a solution is drawn up into a pipette manually by sucking, the risk of contamination is increased. The inside of the pipette is also not sterile. Hence, some precautions should be taken, such as the use of disposable pipettes with a filter, measuring pipettes filled with cotton, or an electric pipetter with a built-in filter.
   

3.8. pHメーター

3.8 pH Meter

3.8.1. 測定手順

3.8.1 Measurement procedure

(1) 電源を入れ、センサー上部のゴムキャップをはずす。 (1) Switch on the power and remove the rubber cap at the top of the sensor.
(2) 比較電極内部液の液面が液絡部より十分上の位置にあることを確認する。不足していれば内部液を補充する。 (2) Check that the surface of the liquid in the comparison electrode is sufficiently above the drainage point. If insufficient, add more liquid.
(3) キャリブレーションを行う。 (3) Calibrate the meter.
(4) センサーを純水で洗浄し、必要ならキムワイプ等で拭く。 (4) Rinse the sensor with pure water and wipe it with Kimwipe if necessary.
(5) 溶液をスターラーで攪拌し、マグネットバーの回転が定常になるまで待つ。pHは溶液を攪拌しながら測定しなければ正しく測定できない。 (5) Agitate the solution using a stirrer and wait until the rotation of the magnet bar is steady. The proper pH cannot be measured unless the pH is measured while the solution is being agitated.
(6) 液絡部(センサー先端部の横にある穴)が浸かるまでセンサーを溶液に浸ける。この穴の位置まで溶液にセンサーが浸かっていなければ正確なpHを測定できない。また、回転するマグネットバーにセンサーが触れて破損しないように注意すること。溶液量が少ない場合は、より細い容器に入れ替えるなどしてマグネットバーとセンサーを近づけない工夫をしなければならない。 (6) Dip the sensor into the solution until the drainage point (a hole in the side of the sensor tip) is dipped. The pH cannot be accurately measured
unless the sensor is dipped into the solution with the drainage point below the surface of the solution. Also exercise caution to avoid contact of the sensor with the rotating magnet bar. In the case of a small amount of solution, take measures to keep the sensor away from the magnet bar, for example, replace the container with a thinner one.
(7) 表示を読む。通常の測定操作では3桁目の表示は信用できない。有効数字が3桁必要な実験の場合、清浄に管理されたセンサーを用い(天然培地などの不純な溶液の測定によって汚れたpHセンサーでは不可)、温度、イオン強度、空気中の炭酸ガスやアンモニアの吸収などに細心の注意を払う必要がある(詳細はpHの理論と測定, 益子安著, 東京化学同人 (1967)などの成書を参照のこと)。 (7) Read the value displayed. Under normal measurement operation, the 3rd digit of the displayed value is unreliable. In case of an experiment requiring 3 significant digits, use a clean sensor (a pH sensor contaminated due to the measurement of impure solution, such as a natural medium, is inapplicable) and carefully monitor the temperature, ionic strength, and absorption of carbon dioxide gas in air and ammonia (for details, refer to books, such as “pH Theory and Measurement,” Yasushi Masuko, Tokyo Chemistry Dojin (1967)).
(8) センサー上部のゴムキャップを閉じる。開けたままだと内部液の水分が蒸発し内部液の塩化カリウムが析出する。塩が析出すると内部液の交換ができなくなり、以後正確なpHの測定ができなくなる。 (8) Return the rubber cap to the top of the sensor. If the sensor is kept open, moisture will evaporate from the interior liquid and potassium chloride salt will precipitate. If salt is deposited, the interior liquid cannot be replaced, causing inaccurate pH measurement.
(9) センサーを純水で洗浄し、純水につける。最近のセンサーは塩化カリウム溶液ではなく、純水に浸けて保存するよう推奨されているものもある。最適な保存液は個々にセンサーの取扱説明書で確認すること。なお、複合型pH電極は、その構造上、微量の内部液(KCl)がpHを測定する溶液に混入することを理解しておかなければならない。カリウムや塩素が混入すると不都合な実験の場合、溶液を2等分し、一方のpH調整に要した酸(またはアルカリ)と等量の酸(またはアルカリ)を他方に加えて調整すると良い。 (9) Rinse the sensor with pure water and imerse it in pure water. Some recent sensors are recommended to be stored not in potassium chloride solution but in pure water. Read the manual and confirm the optimal preservative solution for each sensor. When using a complex-type pH electrode, understand that a small amount of interior liquid (potassium chloride) is mixed into the solution, the pH of which is to be measured because of the structure of the sensor. In the case of an experiment in which the contamination of potassium or chlorine must be avoided, divide the solution into two equal parts and adjust them by adding, to one part, an equivalent amount of the acid (alkali) used for the pH adjustment of the other part.
   

3.8.2. キャリブレーション

3.8.2 Calibration

(1) 標準緩衝液にはいかなる溶液も混入させてはならない (1) Do not mix any solution into the standard buffer solution
センサーは必ず純水で洗浄し、キムワイプ等で水分を拭取ってから標準緩衝液につける。 Rinse the sensor always with pure water and wipe the moisture with Kimwipe, then dip it in the standard buffer solution.
(2) 標準緩衝液の選び方 (2) How to choose the standard buffer solution.
通常はpH 7の標準緩衝液でゼロ点調整を、pH 4の標準緩衝液で感度調整を行う。pH 9 (pH 10)の標準緩衝液もあるが、空気中の炭酸ガスを吸ってすぐにpHが狂うので、必ず新鮮な標準緩衝液を用いること。 Generally, zero adjustment is carried out using pH 7 standard buffer solution and sensitivity adjustment is carried out using pH 4 standard buffer solution. Although there is pH 9 (pH 10) standard buffer solution, it absorbs carbon dioxide gas in air, by which its pH rapidly changes. Be sure to use a fresh standard buffer solution.
(3) 温度に関する注意 (3) Precautions concerning temperature
手動で(自分でツマミを回して)キャリブレーションを行なうタイプのpHメーターの場合、標準緩衝液自体も温度によってpHが変動することに注意しなければならない。即ち、標準緩衝液のその時の温度におけるpHに合せなければならない。例えば、リン酸の標準緩衝液の場合、25℃なら6.86に合わせるが、15℃であれば6.92に合わせなければならない。また、厳密にpHを調整する必要がある場合、清浄に管理されたセンサーと新鮮な標準緩衝液を用い、使用する温度においてキャリブレーションを行わなくてはならない(3.8.3.参照)。 When using a manually-calibrated pH meter (by turning a knob), note that the pH of the standard buffer solution itself also varies depending on temperature. That is, the meter should be calibrated to the pH of the standard buffer solution at the temperature at that time. For example, in the case of phosphoric acid standard buffer solution, calibrate the pH meter to 6.86 at 25oC and 6.92 at 15oC. If an accurate pH adjustment is required, use a clean sensor and a fresh standard buffer solution, and calibrate the meter at the temperature at which it is used (refer to 3.8.3).
   

3.8.3. 温度と希釈

3.8.3 Temperature and dilution

溶液のpHは温度によって変化し、希釈によっても変化する。具体的には例えばトリス緩衝液の場合0℃でpH 8.85の溶液は25℃では8.08に低下する。各種の緩衝液のpHが温度によってどの程度変化するかは蛋白質・酵素の基礎実験法(改訂第2版、堀尾武一編、南江堂)の第12章を参照のこと。また、イオン強度が0.2を超えると液間電位差の影響が次第に顕著になり、正確なpH調整はできなくなる(詳細はpHの理論と測定, 益子安著, 東京化学同人 (1967)などの成書を参照のこと)。温度や液間電位差の影響は実験の目的によっては誤差の範囲を遥かに越える。例えば、pH を8.0に調整したつもりの1 M Tris-HClを100倍希釈して10 mM溶液を調製すると、場合によっては0.5以上pHがずれることもある。緩衝液のpHは使用する温度と濃度で調整するべきである。 The pH of solution varies depending on dilution as well as temperature. For example, in the case of Tris buffer solution, pH 8.85 at 0oC decreases to pH 8.08 at 25oC. Refer to Chapter 12 in Basic Experiment Method Using Protein and Enzyme (2nd revision, Ed. Takekazu Horio, Nankodo) to see how much the pH of each buffer solution varies with temperature. If ionic strength exceeds 0.2, the effect of the electric potential difference between solutions will gradually become marked, causing difficulty in accurate pH adjustment (for details, refer to books such as “pH Theory and Measurement,” Yasushi Masuko, Tokyo Chemistry Dojin (1967)). Some effects of temperature and electric potential difference between solutions may greatly exceed the margin of error in some experiments. For example, if 1 M Tris-HCl that was thought to have been adjusted to pH 8.0 is diluted 100-fold to a 10 mM solution, the pH may deviate by more than 0.5. Adjust the pH of the buffer solution according to its temperature and concentration.
10倍濃度の緩衝液を1 L作成する場合の手順を以下に示す。 The procedure for preparing 1 L of buffer solution at 10-fold concentration is as follows.
(1) 10 L分の試薬を溶解し、メスシリンダーで全量を900 mLとする。 (1) Dissolve an amount of reagent for 10 L of solution, and make it up to 900 mL in total using a measuring cylinder.
(2) メスシリンダーを用いてこのうち90 mLを取り、ビーカーに移して全量を800〜900 mLとする。 (2) Transfer 90 mL from (1) using the measuring cylinder, into a beaker and make it up to 800 – 900 mL in total.
(3) 使用する温度に暖める(冷却する)。 (3) Warm (Cool) to the temperature at which the solution is to be used.
(4) 適当な濃度の酸(アルカリ)を適当な容器に取り、容器ごと重量を測定する(W1)。 (4) Put an acid (alkali) of appropriate concentration into a suitable container and measure the total weight including that of the container (W1).
(5) (3)のpHを(4)の酸(アルカリ)で所定の値に調整する(1 Lにメスアップしてそのまま使用できる)。 (5) Adjust the pH of (3) to a predetermined pH using acid (alkali) (4) (the solution can be made up to 1 L and used as is).
(6) 残った酸またはアルカリの重量を容器ごと測定する(W2)。 (6) Measure the weight of the remaining acid or alkali including that of the container (W2).
(7) W1-W2の9倍量の酸(アルカリ)を(1)の残り(810 mL)に加え、900 mLにメスアップする。 (7) Add acid (alkali) of the amount 9(W1 – W2) to the remainig (1) (810 mL) and make it up to 900 mL.
   

3.9. 分光光度計

3.9 Spectrophotometer

3.9.1. 濁度を測定する場合の注意

3.9.1 Problems in measuring turbidity

(1) 濁度は分光光度計の機種によって異なる (1) Turbidity varies depending on the type of spectrophotometer used.
濁度は、細胞などの粒子によって検出器に届く光が減少することを利用して測定する。このとき、粒子で散乱した光も一部検出器に届く。検出器に届く散乱光の量は、検出器側のスリットの幅が広いほど、セルと検出器の距離が短いほど多くなり、結果として濁度は低くなる。従って、分光光度計のメーカー、型番が異なれば、同じ濁度の試料を測定しても値は異なる。特に酵母などの大型の細胞の場合、機種によっては3倍以上値が異なる場合がある。 Turbidity is evaluated on the basis of the phenomenon that the light reaching the detector is decreased due to interruption by particles, such as cells. At this time, the light scattered by particles partly reaches the detector. The amount of scattered light reaching the detector increases as the width of the slit at the detector side increases or as distance between the cell and the detector decreases, giving a low turbidity. Therefore, when using a different type of spectrophotometer or a spectrophotometer made by a different manufacturer, a different turbidity value is obtained even when measuring the same sample. In particular, in the case of large cells, such as yeast, the turbidity may differ 3-fold or more depending on the type of spectrophotometer used.
(2) 細胞濃度と濁度が比例する範囲 (2) Range in which cell concentration is proportional to turbidity
細胞濃度と濁度が比例する範囲は、測定に用いる分光光度計によって、分光光度計のメインテナンスの状態、対象とする細胞によって異なる。測定に用いるそれぞれの分光光度計について確認すること。 The range in which cell concentration is proportional to turbidity differs depending on the spectrophotometer used, the maintenance condition of the spectrophotometer and the cell of concern. Check the range for each spectrophotometer to be used.
(3) 濁度に影響する他の因子 (3) Other factors affecting turbidity
1) 培地 例えば最少培地と合成培地では、細胞表層の光学的状態が異なり、同じ細胞濃度でも濁度が異なる。 1) Medium: For example, the optical condition of a cell surface is different between the minimum medium and the synthetic medium, and therefore, turbidity differs, even at the same cell concentration.
2) 浸透圧 培地や希釈水の浸透圧が異なれば、細胞が膨張あるいは収縮して濁度は変化する。細胞試料の稀釈には、培地そのものか、培地と同じ浸透圧の食塩水等を用いるべきである。 2) Osmolarity: Depending on the osmolarity of the medium or diluted water, the cell expands or shrinks, resulting in a different turbidity. When diluting a cell sample, use the same medium or saline at the same osmolarity as that of the medium.
3) 菌株 菌株が異なる場合(例えば同じE. coliであっても)、同じ細胞濃度でも濁度は異なる。 3) Strain: If the strains are different (for example, even of the same E. coli), turbidity differs, even at the same cell concentration.
4) 培養フェイズ 対数増殖期、定常期、減衰期それぞれで細胞の状態は異なるので、同じ細胞濃度でも濁度は異なる。 4) Culture phase: The condition of the cell differs depending on its phase, that is, logarithmic phase, stationary phase or extinction phase, and therefore, turbidity differs, even at the same cell concentration.
   

3.9.2. キュベット(セル)

3.9.2 Cuvette (Cell)

石英、ガラス、プラスチックのものがある。石英は紫外部でも使用できるが非常に高価である。用途に応じて使い分けることが望ましい。 Cuvettes are made of quartz, glass or plastic. A quartz cuvette can be used in the ultraviolet region, but is very expensive. Use the cuvette appropriate for each purpose.
   

3.10. 電気泳動

3.10 Electrophoresis

蛋白質や核酸は溶媒に分散させるとコロイド粒子となり、pH、イオン強度、温度が一定の条件ではある荷電Qを持つ。このコロイド溶液に電場EをかけるとコロイドはQEなる力で荷電と反対符号の電極に向かって移動する。この時、粒子に対する溶媒もしくは支持体との摩擦抵抗をf、粒子の移動速度をvとすれば、QE=fvの関係がある。電気泳動における試料の移動速度は電圧によって決まり、電流の大きさは直接関係しない。 Protein or nucleic acid forms colloid particles when dispersed in a solvent, and has a certain amount of charge Q at constant pH, ionic strength and temperature. These colloid particles move toward the electrode with the sign opposite to their charge with the force Q.E when an electric field, E, is applied to the colloid solution. Here, the friction resistance between the solvent or the vessel (?) and particles is f and the particle velocity is ; thus, Q.E = f.  holds. The velocity of a particle during electrophoresis depends on voltage and has no direct relationship with current.
   

3.10.1. 定電圧、定電流、定電力の意味

3.10.1 Meaning of constant voltage, constant current and constant power

電圧(V)=抵抗()×電流(A)、
電力(W)=電圧(V)×電流(A)である。
Voltage (V) = Resistance ()  Current (A),
Power (W) = Voltage (V)  Current (A).
(1) 定電圧 (1) Constant voltage
常に一定の電圧をかける。回路の抵抗が小さければ(緩衝液のイオン濃度が高ければ)大きな電流が流れる。 This means that a constant voltage is always being applied. With a lower circuit resistance (the ion concentration of buffer solution is higher), a higher current flows.
(2) 定電流 (2) Constant current
常に一定の電流を流す。回路の抵抗が大きければ高い電圧がかかる。もし回路が断線していればとんでもない高電圧がかかり(例えば1 Mの回路に1 mAの定電流を流そうとすれば電圧は1000 Vにもなる)、放電、感電等の事故を起こす。安全装置が付いていない電源装置も少なくないので十分な注意が必要である。 This means that a constant current is always flowing. With a higher circuit resistance, a higher voltage is applied. When the wire is broken, a tremendously high voltage is applied (for example, if 1 mA of constant current is planned to flow in a 1 M circuit, 1000 V of voltage is required), causing accidents such as discharge or electric shock. Because there are many power supplies without safety devices, exercise sufficient caution.
(3) 定電力 (3) Constant power
常に一定の電力を消費するように電圧または電流を制御する。シークエンスゲルのように、通電による発熱を一定にしてゲルの温度を一定に保ちたい場合などに使用する。回路の抵抗が大きければ、電流は少なく、電圧は高くなる。安全装置がついている電源装置が多いが、(2)同様に回路の断線には十分な注意が必要である。 This means controlling voltage or current so that a constant power is always consumed. This is adopted, for example, to maintain heat generation by flowing constant current to maintain the temperature of a gel, such as sequence gel, constant. With a higher circuit resistance, a lower current or a higher voltage is required. Although most power supplies are equipped with a safety device, be sufficiently aware of wire breakage, as in the case of (2).
   

3.10.2. 通電手順

3.10.2 Procedure of applying current

(1) 電源スイッチを入れる前に、電源装置の電圧(電流)調整ツマミが最小にセットされていることを確認する。 (1) Check that the voltage (current) adjustment knob on the power supply has been set to minimum before switching on the power.
(2) 回路が正しく接続されているかを確認する。定電流で流す場合、電源−電極−緩衝液−ゲル−緩衝液−電極−電源がつながっているかを確認する。具体的には、 (2) Check that the circuit is properly connected. When applying constant current, check that the power – electrode – buffer solution – gel – buffer solution – electrode – power are connected. That is,
1) 緩衝液を入れ忘れていないか。
2) 緩衝液が漏れてゲルや電極が露出していないか。
3) ゲル作成時に使用したシールチューブを取り忘れていないか。
4) ゲルの下端に泡が入っていないか
1) ensure that the buffer solution is in;
2) ensure that the gel or electrode is not exposed due to leakage of the buffer solution;
3) ensure that the seal tube used in gel preparation is removed;
4) ensure that bubbles do not exist at the bottom of the gel.
(3) 電源を入れる。 (3) Switch on the power.
(4) 電圧計と電流計を見ながら、徐々にツマミを回して電圧を上げる。 (4) Turn the knob gradually to increase voltage, while monitoring the voltmeter and ammeter.
(5) 正常な通電時の電流、電圧と異なる場合は直ちにツマミを最小にして電源を切り、3.10.3.を参考に点検を行う(正常な電流値、電圧値を知らない者は必ず経験者に立ち会ってもらうこと)。 (5) If current or voltage is different from that during normal operation, immediately turn the knob to minimum and switch off the power. Then, inspect the power supply, referring to the procedure in 3.10.3 (those unfamiliar with the normal value of current or voltage must be accompanied with an experienced person).
   

3.10.3. 通電時の異常とその原因

3.10.3 Trouble arising when applying current and its cause

定電流で流すのは危険である。電圧のリミッター機能を持たない電源装置を使う場合、定電流ではなく、定電圧で泳動すること。 It is dangerous to apply constant current. When using a power supply without a voltage limiter function, carry out electrophoresis by applying not a constant current but a constant voltage.
(1) 定電流で泳動した時、電圧が正常時よりも (1) Electrophoresis at constant current
1) 大きい場合
 極端に大きい場合、回路がどこかで切れていると考えられるので、再度3.10.2.(3)の点検を行う。ケーブル、電極の白金線の断線についてもチエックする。また、ゲル作成に用いた緩衝液、泳動に用いる緩衝液の濃度を間違えている(所定濃度よりも薄い)可能性もある。
1) The case of voltage higher than normal
In the case of an extremely high voltage, the wire is considered to be broken somewhere. Therefore, inspect it again as described in 3.10.2(3). Also check for any breakage of the cable or platinum wire in the electrode. There is also the possibility that the buffer solution concentration used for gel preparation and that used for electrophoresis are wrong (lower concentration than predetermined).
2) 小さい場合
 回路がどこかでショートしている可能性がある。また、ゲル作成に用いた緩衝液、泳動に用いる緩衝液の濃度を間違えている(所定濃度よりも濃い)可能性もある。
2) The case of voltage lower than normal
There may be a short-circuit somewhere. There is also the possibility that the buffer solution concentration used for gel preparation and that used for electrophoresis are wrong (higher concentration than predetermined).
(2) 定電圧で泳動した時、電流が正常時よりも (2) Electrophoresis at constant voltage
1) 大きい場合
 回路がどこかでショートしている可能性がある。ゲル作成に用いた緩衝液、泳動に用いる緩衝液の濃度を間違えている(所定濃度よりも濃い)可能性もある。
1) The case of current higher than normal
There may be a short-circuit somewhere. There is also the possibility that the buffer solution concentration used for gel preparation and that used for electrophoresis are wrong (higher concentration than predetermined).
2) 小さい場合
 極端に小さい場合、回路がどこかで切れていると考えられるので再度3.10.2.(3)の点検を行う。ケーブル、電極の白金線の断線についてもチエックする。ゲル作成に用いた緩衝液、泳動に用いる緩衝液の濃度を間違えている(所定濃度よりも薄い)可能性もある。
2) The case of current lower than normal
In the case of an extremely low current, the wire is considered to be broken somewhere. Therefore, inspect it again as described in 3.10.2(3). Also check for any breakage of the cable or platinum wire in the electrode. There is also the possibility that the buffer solution concentration used for gel preparation and that used for electrophoresis are wrong (lower concentration than predetermined).
   

3.10.4. 核酸のアガロースゲル電気泳動

3.10.4 Agarose gel electrophoresis (AGE) of nucleic acid

(1) ゲルの作成 (1) Gel preparation
1) 所定の緩衝液にアガロースを加え、完全に溶解する。オートクレーブを用いるのが望ましい。電子レンジで加熱して溶解することができるが(突沸による火傷に十分に注意すること)、完全に溶解させないと良い泳動パターンは得られない。なお、過剰に加熱して水分の蒸発量が多ければ、ゲル濃度が上がると同時に、緩衝液の濃度も上がることに注意せよ(3.10.2.(2)-1)参照)。 1) Add agarose to the predetermined buffer solution and dissolve it completely. It is desirable to use an autoclave. Although agarose can be dissolved by heating in a microwave oven (take sufficient precautions against burns caused by sudden boiling), a good electrophoretic pattern cannot be obtained unless the agarose is dissolved completely. Note that the concentration of the buffer solution increases, as does gel concentration, if it is overheated and the amount of moisture evaporation increases.
2) 50〜60℃まで冷やしてからゲルメーカーに注ぐ。熱すぎるとゲルメーカーを変形させ(変形すれば均一な厚さのゲルを作れなくなる)、冷めすぎるとゲルの網目構造が一定ではなくなり、泳動パターンが乱れる。 2) Cool the mixed solution to 50 – 60oC and pour it into the gel maker. If the solution is too hot, it will deform the gel maker (if the gel maker is deformed, a gel with uniform thickness can no longer be prepared). If the solution is too cold, the obtained gel will have an inconsistent meshed structure that causes a disturbed electrophoretic pattern.
3) 水平な場所で固化させる(ゲルの厚みが均一でなければ均一に泳動できない)。固化が完全でない場合、泳動パターンは乱れ、多くの場合ディフューズしたバンドになる。ラップで覆って冷蔵庫に20〜30分入れて完全に固化させると良い。なお、ラップで覆わずに放置すれば、ゲル表面のゲル濃度が上がり、ディフューズしたバンドになる(図7A)。 3) Solidify the solution on a horizontal surface (uniform electrophoresis cannot be achieved unless the gel thickness is uniform). If the solution is not completely solidified, the electrophoretic pattern will be disturbed, and in most cases, a diffused band will be obtained. It is desirable to store the gel solution covered with polyethylene wrap in the refrigerator for 20 – 30 minutes to solidify it completely. If the gel solution is left without wrapping, the gel concentration of the gel surface increases and a diffused band is obtained (Fig. 7A).
(2) 緩衝液及びサンプルのアプライに関する注意 (2) Problems concerning the application of buffer solution and sample
1) ゲルの溶解に使用した緩衝液と、泳動に使用する緩衝液の濃度が異なれば、ゲルの表面に近い部分と遠い部分で移動度が異なり、結果としてディフューズしたバンドになる。 1) If the concentration of the buffer solution to be used for electrophoresis is different from that of the buffer solution used for dissolution of gel, the mobility will be different between the parts closer to and those further from the gel surface, resulting in a diffused band.
2) 泳動時に温度が上昇すれば(40℃以上は危険)ゲルの網目構造が乱れ、ディフューズしたバンドになる。1×TAE緩衝液を用いると発熱が大きいので、これを倍に希釈した1/2×TAE緩衝液を用いるべきである。通常の核酸のアガロースゲル電気泳動は定電圧で行うので、緩衝液を倍に希釈すれば電流は半分になり、発熱は半分になる(この場合、ゲルも半分に希釈した緩衝液で作成すること)。 2) If the temperature increases during electrophoresis (an increase of 40oC or more is dangerous), the meshed structure of the gel will be disturbed, resulting in a diffused band. Because the amount of heat generated is high when using 1TAE buffer solution, dilute twofold to 1/2TAE buffer solution for use. Because agarose gel electrophoresis of nucleic acid is normally carried out at a constant voltage, current, as well as the amount of heat generated, decreases by half if the buffer solution is diluted twofold (in this case, prepare a gel using half-diluted buffer solution).
3) 同じDNA量でもサンプルの体積が少なければ局所的にオーバーチャージとなりテーリングする(図7C)。 3) Even when using the same amount of DNA, if the volume of the sample is small, it is locally overcharged, causing tailing (Fig. 7(C)).
4) サンプルのイオン強度が異なれば移動度は異なる。これはMupidなどを用いて短時間で泳動する場合特に顕著である。例えば、H buffer及びL bufferを用いて制限酵素処理したDNAの移動度を厳密に比較したい場合、それぞれに1/9量の水及び1 M NaClを加え、試料のイオン強度をそろえてから泳動するべきである。 4) The mobility varies depending on the ionic strength of the sample. It varies particularly markedly in the case of electrophoresis for a short period using Mupid. For example, to precisely compare the mobilities of restriction-enzyme-treated DNA using H buffer and L buffer, add 1/9 volumes each of water and 1 M NaCl to each buffer to adjust the ionic strength of the sample before starting electrophoresis.
   

3.10.5. ポリアクリルアミドゲルの作成

3.10.5 Polyacrylamide gel preparation

(1) ゲルの作成に失敗する主な原因 (1) Main reasons for failure of gel preparation
1) 過硫酸アンモニウムに問題がある。 1) There is a problem with ammonium persulfate.
2.8.4.(4)に示す方法で調製保管すればほとんどの場合問題はない。 If adjusted and stored following the method described in 2.8.4(4), ammonium persulfate will present no problem in most cases.
2) 脱気が不十分。 2) The solution is not sufficiently degassed.
溶存する酸素はゲル重合を阻害するので、ゲル溶液は十分に脱気しなければならない(3.10.2.(2)参照)。 Because the dissolved oxygen prevents gel polymerization, the gel solution must be sufficiently degassed (refer to 3.10.2(2)).
3) ゲル溶液の温度が低い。 3) The temperature of the gel solution is low.
重合は化学反応であるからゲル溶液の温度が低ければ反応は遅い(一般に10℃温度が下がれば反応速度は半分に低下する)。また、温度が低ければ気体の溶解度が高くなるので脱気が不十分になる。 If the temperature of the gel solution is low, the polymerization proceeds slowly because it is a chemical reaction (in general, the reaction rate decreases by half as the temperature decreases by 10oC). Gas solubility increases as the temperature decreases, and the solution becomes insufficiently degassed.
4) ゲルの重合が早すぎる。 4) The gel is polymerized too early.
ゲルの重合が早すぎる場合、十分に脱気した後(先に冷やすと脱気しにくくなるので注意)、過硫酸アンモニウムを入れる前に溶液を氷で冷やして重合速度を調整するのが簡便である。過硫酸アンモニウムの量を減らしても良い。 If the gel is polymerized too early, a simple solution is to cool the gel solution with ice, before adding ammonium persulfate to the solution, to adjust the polymerization rate after sufficiently degassing the solution (caution: when the solution is first cooled, degassing will become difficult). One can also decrease the amount of ammonium persulfate added.
(2) ゲル溶液の簡便な脱気方法 (2) Simple method for degassing gel solution
1) SDS、TEMED、過硫酸アンモニウム溶液以外の溶液を、減圧に耐える適当な大きさの容器に取り、室温(20〜30℃)まで暖める。減圧脱気は、ヘッドスペースが小さいほど効率が良い。ビーカーをデシケーターに入れて脱気するよりも、減圧に耐える小さな容器に入れた方が効率が良い。ただし、小さすぎると突沸した時に対応できないので注意すること。 1) Put a solution other than SDS, TEMED and ammonium persulfate solutions into an appropriately sized container that is resistant to decompression, and heat it to room temperature (20 - 30oC). The smaller the head space, the more efficiently the gel solution is depressurized and degassed. It is better to degas the solution in a small container that is resistant to decompression than in a beaker in a desiccator. However, note that the container becomes ineffective for sudden boiling if it is too small.
2) 超音波洗浄機に容器を浸けるか、小さいマグネットバーを入れて攪拌しながら、減圧脱気する。 2) Depressurize and degas the solution, by holding the container in an ultrasonic washing machine or with constant stirring of the gel solution with a small magnet bar placed in the solution.
3) SDS、TEMED、過硫酸アンモニウム溶液をこの順に入れ、容器にフタをして(パラフィルムをかけ)穏やかに数回逆さにして混合し、ゲルプレートに注ぐ。 3) Put SDS, TEMED and ammonium persulfate solutions into the container in this order and close the lid (cover with Parafilm). Then, gently turn the container upside down several times to mix the resulting solution, and pour it into a gel plate.
   

3.10.6. 蛋白質のポリアクリルアミドゲル電気泳動

3.10.6 Polyacrylamide gel electrophoresis of protein

Tris-Glycine系の電気泳動においては、分離ゲル、濃縮ゲル、泳動緩衝液の組成の差を巧みに利用して蛋白質バンドの濃縮を行っている(蛋白質・酵素の基礎実験法改訂第2版、堀尾武一編、南江堂の第6章参照)。従って、サンプルの緩衝液組成は濃縮ゲルとそれと同じであるのが理想である。濃縮ゲルの緩衝液は62.5 mM Tris-HCl pH 6.8であるから、試料のpHがこれと大きく異なったり、高濃度の塩や核酸を含んでいれば、蛋白質バンドは濃縮ゲル中でうまく濃縮できない。きれいな泳動パターンを得たい場合、以下の操作が必要である。 In electrophoresis in a Tris-glycine system, the composition difference among the resolving gel, concentrating gel and electrophoretic buffer solution is effectively used to concentrate the protein band (refer to Chapter 6 in Basic Experiment Method Using Protein and Enzyme (2nd revision, Ed. Takekazu Horio, Nankodo)). Therefore, it is ideal for the buffer solution composition of the sample to be the same as that of the concentrating gel. The buffer solution used for the concentrating gel is 62.5 mM Tris-HCl with pH 6.8. If the pH of the sample deviates from that value or the sample contains salt or nucleic acid at high concentration, the protein band cannot be sufficiently concentrated in the concentrating gel. To obtain a good electrophoretic pattern, the following operations are required.
(1) 試料のpHが異なる場合 (1) When the pH of the sample is different from that of the concentrating gel
pH試験紙を用い、0.1 M HClまたはNaOHで試料のpHを 6.7〜6.9に調整する。 Using pH-test (litmus) paper, adjust the pH of the sample to 6.7 – 6.9 by adding 0.1 M HCl or NaCl.
(2) 試料のイオン強度が高い場合 (2) When the ionic strength of the sample is high
1) 水で希釈して泳動し、より感度の高い染色法を用いて染色する(例えば銀染色はCBB染色よりも1桁以上感度が高い)。 1) Carry out electrophoresis of the sample diluted with water, and stain the gel by a high-sensitivity staining method (for example, silver staining is more sensitive than CBB staining by one order of magnitude or more).
2) 限外濾過、透析などによって脱塩する(pH調整も同時に行える)。分子量10 k以下の低分子蛋白質を扱う場合を除いて、適当な排除限界を持つ市販の限外濾過カートリッジを用いて脱塩するのが最も簡便である。 2) Desalt the sample by ultrafiltration or dialysis (pH can be adjusted at the same time). Except when treating low-molecular protein with 104 molecules or less, it is simplest to desalt the sample using a commercially available ultrafiltration cartridge with a moderate exclusion limit.